L-瓜氨酸对子痫前期中的氧...养层细胞侵袭的调控机制研究_吴益青.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.006L-瓜氨酸对子痫前期中的氧化应激和滋养层细胞侵袭的调控机制研究*吴益青1计静1李亚妮1邢燕妮1王瑞2（西北妇女儿童医院 1 产二科；2 产一科 陕西 西安 710061）摘要 目的：研究 L-瓜氨酸（L-Cit）对子痫前期（PE）大鼠模型的治疗作用，及其对氧化应激和滋养层细胞侵袭的影响。方法：建立N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的 PE 大鼠模型后，将大鼠分为 Control 组、PE 组、PE+低、中和高剂量 L-Cit 组（依次为L-L-Cit、M-L-Cit 和 H-L-Cit 组，剂量依次为 100、200 和 500 mg/kg），n=6，连续给药 7 d。在孕第 21 d 时，检测各组大鼠收缩压（SBP）、24 h 尿蛋白、血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，并对胎盘组织进行苏木精伊红（HE）染色。将 HTR-8/Svneo 细胞分为 Control 组、缺氧/复氧（H/R）组、H/R+L-Cit 组和 H/R+L-Cit+sc-221593 组，分别对细胞进行 H/R 处理，并使用 L-Cit（200g/mL）和特异性 ERK1/2 抑制剂 sc-221593（10 mol/L）培养细胞 48 h。通过 Transwell 测定细胞侵袭。通过 Western blotting 检测total-ERK1/2、p-ERK1/2、total-p38、p-p38、基质金属蛋白酶（MMP）-2 和 MMP-9 的蛋白表达。结果：与 PE 组比较，L-L-Cit 组、M-L-Cit 组和 H-L-Cit 组的 SBP 和 24 h 尿蛋白水平均降低（P0.05）；胎盘组织形态明显改善；血清 SOD 升高，MDA 降低（P0.05）；胎盘组织中 ERK1/2 和 p38 的磷酸化水平及 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达水平均升高（P0.05）。与 H/R 组比较，H/R+L-Cit 组的侵袭细胞数量升高（P0.05）；ERK1/2 和 p38 的磷酸化水平及 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达水平均升高（P0.05）。与 H/R+L-Cit 组比较，H/R+L-Cit+sc-221593 组的上述变化均被逆转（P0.05）。结论：L-Cit 可能通过激活 ERK/JNK 通路减轻 PE 中的氧化应激并促进滋养层细胞侵袭，从而减轻 PE 症状。关键词：子痫前期；L-瓜氨酸；氧化应激；滋养层细胞；侵袭中图分类号：R-33；R714.245文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-232-07The Regulatory Mechanism of L-Citrulline on Oxidative Stress andTrophoblast Invasion in Preeclampsia*WU Yi-qing1,JI Jing1,LI Ya-ni1,XING Yan-ni1,WANG Rui2(1 2nd Obstetrics;2 1st Obstetrics,North-West Women and Childrens Hospital,Xian,Shaanxi,710061,China)ABSTRACT Objective:To investigate the therapeutic effect of L-Citrulline(L-Cit)on preeclampsia(PE)rat model and its effect onoxidative stress and trophoblast cell invasion.Methods:After establishing the PE rat model induced by N-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME),the rats were divided into Control group,PE group,PE+low,middle and high dose L-Cit groups(L-L-Cit,M-L-Cit andH-L-Cit groups in sequence,with doses of 100,200 and 500 mg/kg in sequence),n=6,continuous administration for 7 days.On the 21stday of pregnancy,systolic blood pressure(SBP),24-hour urinary protein,serum superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured,and placental tissue was stained with hematoxylin-eosin(HE).The HTR-8/Svneo cells were divided into Controlgroup,hypoxia/reoxygenation(H/R)group,H/R+L-Cit group and H/R+L-Cit+sc-221593 group.The cells were treated with H/R,respec-tively,and cultured with L-Cit(200 g/mL)and the specific ERK1/2 inhibitor sc-221593(10 mol/L)for 48 h.Cell invasion was deter-mined by Transwell assay.The protein expressions of total-ERK1/2,p-ERK1/2,total-p38,p-p38,matrix metalloproteinase(MMP)-2 andMMP-9 in placental tissues and cells were detected by Western blotting.Results:Compared with PE group,the SBP and 24 h urinaryprotein levels of the rats in L-L-Cit group,M-L-Cit group and H-L-Cit group were decreased(P0.05);the placental tissue morphologywas significantly improved;serum SOD was increased,while MDA was decreased(P0.05);the phosphorylation levels of ERK1/2 andp38 and the protein expression levels of MMP-2 and MMP-9 in placental tissue were increased(P0.05).Compared with H/R group,thenumber of invasive cells in H/R+L-Cit group increased(P0.05);the phosphorylation levels of ERK1/2 and p38 and the protein expres-sion levels of MMP-2 and MMP-9 increased(P0.05).Compared with the H/R+L-Cit group,the above changes in theH/R+L-Cit+sc-221593 group were reversed(P0.05).Conclusions:L-Cit may alleviate the symptoms of PE by reducing oxidative stressin PE and promoting trophoblast invasion by activating the ERK/JNK pathway.Key words:Preeclampsia;L-citrulline;Oxidative stress;Trophoblast;InvasionChinese Library Classification(CLC):R-33;R714.245Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)02-232-07*基金项目：陕西省重点研发计划项目-社会发展领域（2021SF-009）作者简介：吴益青（1978-），女，硕士，副主任医师，E-mail:YQ通讯作者：王瑞（1975-），女，E-mail:（收稿日期：2022-06-30 接受日期：2022-07-27）232现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023前言子痫前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期常见的特发性疾病。虽然 PE 的确切病因尚不清楚，但普遍认为滋养层侵袭不足引起的螺旋动脉重构受损是本病的主要病因1。据报道，螺旋动脉重构受损可引起胎盘血液供应不足并使胎盘处于持续低氧状态，导致滋养层细胞的侵袭能力降低，并发生胎盘浅着床，从而引起 PE 的发生1,2。因此，抗氧化是治疗 PE 的有效策略。瓜氨酸是西瓜汁中发现的非蛋白质氨基酸，其主要存在形式为 L-瓜氨酸（L-Citrulline，L-Cit）3，其可作为 L-精氨酸的前体化合物4。文献报道，L-精氨酸能够降低 L-NAME 诱导的妊高征小鼠尿蛋白和血压水平5，然而，L-精氨酸在体内代谢过快，限制了其临床应用6。因此，本研究考察了 L-Cit 对一氧化氮合酶抑制剂 N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine-methylesterhy-drochloride，L-NAME）诱导的 PE 大鼠的治疗作用，并通过建立人绒毛膜滋养层细胞（HTR-8/Svneo）缺氧/复氧（Hypoxia/re-oxygenation，H/R）模型，进一步研究了 L-Cit 对滋养层细胞侵袭能力的影响及机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验试剂L-Cit（货号：C7629）购自美国 Sigma 公司。ERK1/2 抑制剂 sc-221593（货号：CAS 1049738-54-6）购自美国Santa Cruz 公司。L-NAME（货号：ST1555-10g）、苏木精和伊红（HE）染色试剂盒（货号：C0105M）、Cell Counting Kit-8（货号：C0038）、RIPA 裂解液（货号：P0013C）、BCA 蛋白测定试剂盒（P0012S）、BeyoECL Plus（货号：P0018S）购自碧云天生物技术研究所。超氧化物歧化酶（SOD，货号：A001-3-2）试剂盒、丙二醛（MDA，货号：A003-1-2）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。RPMI1640 培养基（货号：R8758）购自美国 Sigma 公司。Transwell 测定（货号：3422）购自美国 Corning 公司。total-ERK1/2（ab184699）、p-ERK1/2（ab201015）、total-p38（ab170099）、p-p38（ab178867）、基质金属蛋白酶（MMP）-2（ab51075）、MMP-9（ab76003）、-actin（ab8227）和 IgG-HRP（ab205719）抗体购自英国 Abcam 公司。1.1.2 实验动物和细胞40 只 7-8 周龄雌性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重 200