miR-18b-5p调控W...胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响_苏保寿.pdf

收稿日期 修回日期 基金项目 海南省卫生计生行业科研项目（）作者单位 海南省儋州市人民医院 神经外科，病理科，作者简介 苏保寿（），男，主治医师文章编号（）基础医学 调控 对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响苏保寿，薛治乾，余鹏飞，吴益敏，喻闻庆摘要目的：研究 对胶质瘤 细胞增殖、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法：检测癌旁组织和胶质瘤组织中 的表达，法和流式细胞术检测胶质瘤 细胞增殖和凋亡率，检测包含 域的氧化还原酶基因（）、和 蛋白表达，双荧光素酶报告系统验证 和 的调控关系。结果：与癌旁组织相比，胶质瘤组织中 的表达量升高（）。抑制 表达可以抑制胶质瘤 细胞增殖并促进细胞凋亡；靶向负调控 的表达；过表达 可抑制 细胞增殖并诱导细胞凋亡；抑制 表达逆转了抑制 表达对 细胞增殖、凋亡的影响（）。结论：可能通过靶向调控 表达抑制胶质瘤 细胞增殖并诱导细胞凋亡，是胶质瘤潜在的分子靶点。关键词 胶质瘤；细胞；包含 域的氧化还原酶基因中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：（），：，（）（）：；胶质瘤是原发性脑肿瘤，起源于神经胶质干细胞或祖细胞，其基因多态性与病人预后及生存时间有关，虽然手术、放疗和烷基化剂化疗是治疗的主要手段，但个体化治疗策略可改善预后和延长生存时间。研究胶质瘤细胞增殖和凋亡的分子机制，可为胶质瘤病人提供个体化策略并改善预后。有研究用芯片筛选胶质瘤组织中差异表达的，并将胶质瘤组织和非肿瘤脑组织进行聚类分析发现 在胶质瘤中上调表达；另一研究通过实时荧光定量 进一步验证了 在胶质瘤中高表达；但 对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响目前还不清楚。包含 域的氧化还原酶基因（）在胶质瘤组中的表达明显低于正常对照组，基因缺失或低表达在胶质瘤发生过程中起重要作用，且上调 的 表 达 可 促 进 胶 质 瘤 的 免 疫 反 应。和 在胶质瘤发生发展中都具有重要作用，而两者是否存在某种调控关系尚不明确。本研究探讨了 对胶质瘤 细胞增殖、凋亡的影响，并探讨 在此机制中的作用。现作报道。材料与方法 材料选取 年 月至 年 月于本院病理检查确诊为胶质瘤的病人手术切除的胶质瘤组织及癌旁组织（距离胶质瘤组织边缘 ）各蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 例，男 例，女 例，年龄 （）岁，胶质瘤分级：级 例、级 例、级 例、级 例。所有病人术前未接受放疗和化疗。本研究通过医院医学伦理委员会批准，并与所有病人签订知情同意书。试剂与仪器人胶质瘤细胞株 购自美国；高糖培养基和胎牛血清（）购自美国 公司，牛血清白蛋白（）、胰蛋白酶、四氮唑蓝（）和二甲基亚砜（）购自美国 公司；试剂、试 剂 盒、反 转 录 试 剂 盒（）、转染试剂购自美国 公司；双荧光素酶报告系统购自美国 公司；引物、干扰物（）、（）、抑制剂（）、阴性对照（、和）、双荧光素酶报告系统 突变型和野生型载体购自上海吉玛制药有限公司；抗体、抗体、抗体、抗体、抗体和 抗体购自英国 公司；流式细胞仪和流式试剂盒（购自美国 公司）；显微镜、全自动酶标仪及 仪（购自美国 公司）。方法 细胞培养将胶质瘤 细胞培养于含、青 链霉素、谷氨酰胺和丙酮酸钠的 高糖培养液中，置于湿度、培养箱中培养。待细胞铺满瓶底时，消化传代，进行后续实验。细胞转染 将对数生长期的 细胞以 个细胞 孔接种于 孔板中，培养细胞至融合度达到 时进行转染。无血清 培养液稀释脂质体和各载体或片段，包括、和 的载体，将等体积脂质体与各组载体轻柔混匀，室温孵育 ，加入培养好的细胞中，混匀后常规培养，弃上清液，换成 完全培养基，转染 ，收集细胞，通过 验证转染效果。检测 的表达 收集各组转染后培养 的 细胞、胶质瘤组织和癌旁组织，用 试剂提取细胞总，保存于。然后取总 按照反转录 试剂盒说明书合成，同样 保存。按照 的说明书取 进行反应合成，反应程序为：；、，个循环；。根据 方法进行数据分析。实验测定细胞增殖收集转染后 的 细胞，消化细胞并用培养液稀释细胞，以 个细胞 孔接种于 微孔板中，分别在培养至、时进行 实验，每孔加入 （），继续培养 ，弃上清液，每孔加入 ，室温振荡 溶解结晶，酶标仪测定 吸光度值。流式细胞术检测细胞凋亡率将转染后培养至对数生长期的各组 细胞，接种于 孔板中，继续培养，收集细胞，洗涤 次，根据流式试剂盒说明书操作，加入 重悬细胞，加入 和 碘化丙啶，室温避光 ，再加入 ，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。检测蛋白表达收集转染后培养至对数生长期的 细胞，加入细胞裂解液，室温裂解细胞 ，超声破碎细胞，收集蛋白并检测蛋白浓度，将蛋白样本进行 分离，转 膜，室温封闭 ，然后将膜加入稀释的一抗中（抗体 、抗体 、抗体 、抗体 、抗体 和 抗体 ），过夜，用缓冲液洗膜 次，加入稀释后的酶标二抗，室温孵育，洗膜，显影。分析蛋白表达量。双荧光素酶报告系统实验 细胞培养，当细胞融合度达到 时，进行转染，将构建的 的野生型（）和突变型（）双荧光素酶报告载体分别共转染 或，培养，收集细胞，裂解细胞，离心收集裂解后的上清液，加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算 和 的相对萤火虫荧光素酶活性。统计学方法 采用两独立样本（或）检验和配对 检验、方差分析和 检验。结果 在胶质瘤组织和胶质瘤瘤旁组织 ，中的表达 与瘤旁组织（）相比，在胶质瘤组织中 的表达量（）升高（，）（见图）。抑制 表达可抑制胶质瘤 细胞增殖并促进细胞凋亡与 组相比，组的 表达量下降，细胞活性在、和 均下降，增殖相关蛋白 表达量下降，表达升高，细胞凋亡率上升，凋亡蛋白 表达上升，抗凋亡蛋白 表达降低（）（见图 和表 ）。表 抑制 表达对细胞 凋亡率及细胞活性的影响（；）分组凋亡率 细胞活性 表 抑制 表达对细胞 中 、蛋白表达的影响（）分组 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 靶向调控 的序列中含有与 互补的核苷酸序列（见图）。双荧光素酶报告系统结果显示，与对照 组相比，组野生型 的萤火虫荧光素酶相对活性下降（），而突变型 的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化（）（见表）。与 组相比，组的 蛋白表达量降低；与 组相比，组的 表达量升高，差异有统计学意义（）（见表）。过表达 可抑制 细胞增殖和诱导细胞 凋 亡 与 组 相 比，组的 蛋白表达量升高，增殖蛋白 表达降低，表达上升，细胞活性在、和 均下降，凋亡蛋白 表达升高，抗凋亡蛋白 表达下降，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（）（见图 和表 ）。抑制 表达能逆转抑制 对 细胞增殖、凋亡的影响与 组相比，组的 蛋白表达量升高，表达量下降，细胞活性在、和 均下降，表达量下降，表达升高，细胞凋亡率上升，表达上升，表达降低（），组与 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 组结果差异无统计学意义（），与 组相比，组与 组结果相反（）（见图 和表 ）。表 双荧光素酶报告实验（）分组 示 值表 蛋白蛋白的表达（）分组 蛋白 组内 检验：与 组比较 ；与 组比较；与 组比较 表 过表达 对细胞 的细胞活性及凋亡率的影响（）分组凋亡率细胞活性 示 值表 过表达 对细胞 中 、蛋白表达的影响（）分组 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 示 值表 抑制 表达能逆转抑制 对细胞 的细胞活性就凋亡率的影响（）分组凋亡率 细胞活性 组内 检验：与 组比较 ，；与 组比较，；与 组比较 ，讨论 在胶质瘤中差异表达，可能是胶质瘤的诊断和预后生物标志物。富含于大脑，其差异表达对胶质瘤的发生起重要作用，其参与受体酪氨酸激酶信号传导、血管生成、侵袭、分化抑制、细 ，胞周期增强和凋亡抑制。识别关键的 也可为开发胶质瘤有效的生物标志物和抑制性 策略提供依据。表 抑制 表达能逆转抑制 对细胞 中 、蛋白表达的影响（）分组 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 组内 检验：与 组比较；与 组比较；与 组比较 在多种肿瘤组织中表达异常。等最新研究发现，在紫杉醇抵抗的乳腺癌细 胞 株 中，是 的直接靶点，可通过上调 靶向结合，从而减轻乳腺癌细胞的侵袭、转移和上皮间充质转化。在结直肠癌病人血浆和大肠癌组织中表达上调，通过下调 表达诱导 信号通路持续活化，促进大肠癌发生发展。在前列腺癌中表达降低，与肿瘤恶性程度有关，对预测前列腺癌具有较高的敏感性和特异性。研究 发现，在胶质瘤组织中表达上调，其作用尚不清楚。本研究结果发现，与癌旁组织相比，在胶质瘤癌组织中 的表达量显著升高，抑制 表达可以抑制胶质瘤 细胞增殖并促进细胞凋亡，说明 在胶质瘤中具有重要作用。本研究通过生物信息学预测发现，的中含有与 互补的核苷酸序列，提示两者可能存在结合位点或调控关系，可能参与 对胶质瘤的调控过程。包含两个 域和一个短链脱氢酶 还原酶域的相对分子质量为 的蛋白质，是一种肿瘤抑制因子，在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、肺癌、胃癌和胰腺癌中表达缺失或减少，位于染色体，跨越人类基因组第二常见的脆弱位点。在多形性胶质母细胞瘤（）中表达下调，其可诱导 突变的 细胞发生凋亡，抑制。在胶质母细胞瘤细胞 中高表达 可抑制细胞增殖和对细胞外基质的黏附力，促进细胞凋亡。对 名中国成年人的研究发现，基因缺失可能易患胶质瘤。本研究结果表明，过表达 可抑制 细胞增殖和促进细胞凋亡，与这些研究结果一致，说明 可抑制胶质瘤。双荧光素酶报告系统结果表明，靶向负调控 的表达，进一步的实验发现，抑制 表达逆转了下调 表达对 细胞增殖、凋亡的影响，说明两者在胶质瘤细胞中具有调控关系。的主要功能是在转录后水平对其靶基因进行负调控，每个 调节多个靶标基因的表达。因此，的调控网络仍需进一步验证。综上，本研究证实 和 在胶质瘤中具有重要的作用，和 有望做为胶质瘤分子诊治靶点。参考文献 ，：，（）：杨立坚 胶质瘤 差异表达的研究 长沙：中南大学，杨立坚，彭健 微阵列芯片分析人胶质瘤 差异表达谱蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 中国误诊学杂志，（）：赵钧慧，周垂贤，刘刚，等 基因在脑胶质瘤中的表达 菏泽医学专科学校学报，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：李一鸣，赵娇，刘娟，等 对大肠癌 信号通路的调控 现代肿瘤医学，（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：（本文编辑 刘梦楠）（上接第 页），：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：王天佐，张莹，薛真真，等 阿尔兹海默病发病机理概述及治疗策略展望 临床医学进展，（）：，（）：，：，（）：姚钱，郑红云，李艳 阿尔兹海默症发病机制研究进展 职业与健康，（）：，（）：，（）：，：，（）：（本文编辑 周洋），