miR-302d的载体构建...Tle4基因的靶向关系验证_吴宇慧.pdf

2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023遗传育种遗传育种miR-miR-302302d d的载体构建的载体构建及其与及其与TleTle4 4基因的靶向关系验证基因的靶向关系验证吴宇慧1，席一凡1，张文慧1，程富富1，胡菜1，赵宗仪1，陈欣雨1，李熠2，张亚妮1*（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州225009；2.温州肯恩大学计算机科学与技术学院，浙江温州325035）摘要：试验旨在探究精原干细胞（SSCs）形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆miR-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro构建miR-302d过表达载体（miR-302d mimics）；合成miR-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建miR-302d干扰载体（miR-302d inhibitor）。通过生物信息预测获得miR-302d靶基因并构建其3UTR的野生型（WT）和突变型载体（MT）；将miR-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞，检测靶基因3UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰miR-302d后靶基因的表达变化。结果显示：成功构建miR-302d的过表达和干扰载体；预测结果显示Tle4为miR-302d的潜在靶基因，且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因；双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中，与转染WT+miR-NC组相比，转染WT+miR-302d组的双荧光素酶活性显著下降（P0.05），且过表达miR-302d后下调Tle4的表达，而干扰miR-302d后上调Tle4的表达。结果表明，miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达。关键词：miR-302d；Tle4；双荧光素酶报告检测中图分类号：S831.2文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-20-07收稿日期：2021-10-20；修回日期：2022-02-14基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1200305）；国家自然科学基金项目（32272857）作者简介：吴宇慧（1998-），女，硕士研究生，研究方向为动物胚胎工程与遗传工程，E-mail：*通讯作者：张亚妮（1977-），女，博士，教授，主要从事家禽遗传育种研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.004Vector Construction of miR-302d and Targeting VerificationBetween miR-302d and Tle4 GeneWU Yuhui1,XI Yifan1,ZHANG Wenhui1,CHENG Fufu1,HU Cai1,ZHAO Zongyi1,CHEN Xinyu1,LI Yi2,ZHANG Yani1*（1.Jiangsu Key Laboratory of Animal Genetics Breeding and Molecular Design,College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009；2.College of Computer Science and Technology，Wenzhou-Kean University，Wenzhou,Zhejiang 325035）Abstract:The experiment aimed to investigate the molecular mechanism of the key miR-302d driving function during theformation of SSCs.miR-302d precursor sequence was cloned and linkaged to PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-202023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023遗传育种遗传育种MicroRNAs（miRNAs）是 一 类 长 度 大 约 为1925 nt的非编码小型RNA，普遍存在真核细胞内，参与基本生物过程的微调，例如细胞的增殖、分化、凋亡1，是机体不可缺少的。miRNA与靶基因mRNA 3非翻译区（3UTR）进行完全互补配对或者不完全互补配对，导致靶基因mRNA被降解或翻译被抑制，从而在转录水平或者转录后水平调控基因的表达，继而参与调控胚胎发育、器官形成、细胞增殖、分化和凋亡等生理或病理过程2。目前，有关miRNAs参与哺乳动物生殖细胞分化的相关报道较多，其在性别决定、生殖干细胞减数分裂和精原细胞分化等方面都起着重要的作用。例如Torleyet等3发现miR-22抑制绵羊胎儿睾丸中雌激素受体1（ESR1）所介导的雌激素信号，能够影响小鼠的性别分化；Eggers等4发现miR-202-5p、miR-202-3p、miR-140-3p睾丸发育中上调，可介导睾丸的形成；刘超等 5 发现miR-34c不只具有调控奶山羊雄性生殖干细胞减数分裂的作用，并且可抑制胚胎干细胞的增殖；Liang等6通过敲除miR-335-3p可以部分挽救GC-2spd细胞的增殖。张姗姗等7发现在过表达鸡Vasa的PGCs细胞系中过表达miR-34c不仅可促进PGCs向生殖细胞分化，且能够与相关信号通路协同调控生殖细胞的发生；此外，Fiedler等8发现miR-212、miR-132对卵泡和卵母细胞的生长有调控作用；Bannister等9研究发现miR-202的表达对鸡的睾丸发育呈正相关；Dabaja等 10 发现miRNA在可育和不育的睾丸细胞中差异表达，如miR-202-5p能在可育的男性睾丸支持细胞中选择性表达，但在不育男性中不表达。这些miRNA可通过MAPK、JAK、STAT、TGF信号通路作用11。以上研究提示，miRNA不仅可通过细胞、组织的特异性表达参与生殖细胞的发生过程，miRNA调节的不平衡还可能导致生殖功能障碍以及胚胎的性别分化，是家禽生殖繁育过程中重要的调控因子。精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）是雄性动物体内具有自我更新、分化能力的成体干细胞，能够将亲本遗传信息传递给子代。SSC可以产生精原细胞，后续产生精子。SSC的形成质量会直接影响精子的质量，从而影响家禽生产中人工授精效率，同时SSC可以用于转基因动物的生产。目前SSC形成机制还未明确，为了探究参与ESCs向SSCs分化过程中的关键miRNA，本实验室利用前期的RNA-seq数据，经GO功能注释和KEGG Pathway信号富集筛选出在视磺酸（Retinoic acid，RA）诱导ESCs向SSCs分化过程中关键的miR-302d。为进一步探究miR-302d在生殖细胞形成过程中的功能，Laing 等12构建了 miR-302d mimics和miR-302d inhibitor载体，通过生物学信息方法预测其靶基因，结果表明Tle4基因是miR-302d靶向调控的潜在靶基因之一，Tle4基因是Tle基因家族的成员，在胚胎发育和形态发生中发挥功能，且研究表明Tle4通过抑制多能基因表达实现胚胎干细胞分化。本试验采用双荧光素酶报告系统验证二者的靶向关系，为后期分析miR-302d参与调控鸡ESCs向SSCs分化的调控机制、提高SSCs的体外形成效率奠定理论基础。to construct miR-302d overexpression vector(miR-302d mimics);miR-302d interference target was synthesized and linkaged toPGMLV-SC5 vector to construct miR-302d interference vector(miR-302d inhibitor).miR-302d target genes was obtained bybioinformatic prediction and wild type vector(WT)and mutant vector(MT)of their 3UTR was constructed.The miR-302d overexpression vector was cotransfected with WT and MT vectors in DF-1 and 293T cells respectively to detect the activity of the target gene 3UTR.The changes of target gene expression after overexpression or interference with miR-302d in DF-1 cells were also detected.The results showed that the overexpression and interference vectors of miR-302d were successfully constructed.Theprediction results showed that Tle4 was a potential target gene of miR-302d and it was an important gene in the process of differentiation of ESCs into SSCs;The results of dual luciferase activity assay showed that both in DF-1 and 293T cells,compared withthe transfected WT+miR-NC group,the dual luciferase activity of transfected WT+miR-302d group showed a significant decrease in dual luciferase activity(P0.05),and the expression of Tle4 was down-regulated after overexpression of miR-302d,while theexpression of Tle4 was up-regulated after interference with miR-302d.The result indicated that miR-302d could directly regulate the expression of the target gene Tle4.Key words:miRNA-302d;Tle4;luciferase reporter vector-212023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.20231材料与方法1.1主要材料与仪器pMIR-REPORTTM双荧光素酶报告载体与pRL-TK内参质粒由实验室前期储存；3UTR野生型pMIR-REPORT重组质粒、DH5感受态、DF-1细胞、人肾上皮细胞293T细胞由本试验室购买保存；DMEM培养基和同源重组酶购自南京擎科生物科技有限公司。Dual-LuciferaseReporter Assay System 检测试剂盒、去内毒素小提质粒试剂盒、去内毒素大提质粒试剂盒、基因组提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均来自北京天根生化科技有限公司；FuGENE转染试剂盒购自Promega公司，质粒抽提试剂盒购自Qiage