半乳糖凝集素4在非小细胞肺...其对增殖、迁徙及凋亡的影响_罗丹.pdf

中国当代医药2023年1月第30卷第3期CHINA MODERN MEDICINE Vol.30 No.3 January 2023论著半乳糖凝集素 4 在非小细胞肺癌细胞中的表达及其对增殖、迁徙及凋亡的影响罗丹1，2梁玉灵1方梦莹1陈梦晴1王文军1吴其标2范贤明11.西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川泸州 646000；2.澳门科技大学中医药学院，澳门 999078摘要目的探讨半乳糖凝集素 4（Gal-4）在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的表达及对细胞增殖、迁徙及凋亡的影响。方法选取 NSCLC 细胞作为实验组，正常支气管上皮细胞作为对照组；应用 RT-PCR 和 Western blot 检测NSCLC 细胞中 Gal-4 mRNA 及蛋白的表达；选取 Gal-4 蛋白表达最高、最稳定的细胞株转染 siRNA 以下调 Gal-4表达，应用 FAM-siRNA 及 Western blot 观察及检测转染效率；应用 CCK8、划痕实验、流式细胞术观察下调 Gal-4表达对 NSCLC 细胞增殖、迁徙及凋亡的影响。结果实验组的 Gal-4 mRNA 及蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。A549 细胞转染 siRNA 后，实验组的 Gal-4 蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；下调 A549 细胞 Gal-4 表达后，实验组细胞的增殖能力低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。下调 A549 细胞 Gal-4 表达后，实验组划痕愈合慢于对照组，差异有统计学意义（P=0.043）。下调 A549 细胞 Gal-4 表达后，实验组与对照组的细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P=0.085）。结论Gal-4 在 NSCLC 细胞中高表达，促进 NSCLC 细胞的增殖及迁徙能力。关键词半乳糖凝集素4；非小细胞肺癌；增殖；迁徙中图分类号 R734.2文献标识码 A文章编号 1674-4721（2023）1（c）-0013-05Expression of galectin-4 in non-small cell lung cancer cells and its effecton cell proliferation,migration and apoptosisLUO Dan1，2LIANG Yuling1FANG Mengying1CHEN Mengqing1WANG Wenjun1WU Qibiao2FAN Xianming11.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,SichuanProvince,Luzhou646000,China;2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Macau University ofScience and Technology,Macau 999078,ChinaAbstract Objective To explore the expression of galectin 4(Gal-4)in non-small cell lung cancer(NSCLC)cells and itseffect on cell proliferation,migration,and apoptosis.Methods NSCLC cells were chosen as the experimental group andnormal bronchial epithelial cells as the control group.The expression of Gal-4 mRNA and protein in NSCLC cells weredetected by RT-PCR and Western blot.The cell line with the highest and most stable Gal-4 protein expression was selectedtotransfect siRNA todown-regulateGal-4 expression.The transfection efficiency was observed and detected by FAM-siRNAand Western blot.The effect of down-regulated Gal-4 expression on proliferation,migration and apoptosis of NSCLC cellswere respected by CCK8,scratch test and flow cytometry.Results The mRNA and protein expression levels of Gal-4 in theexperimentalgroupwerehigherthanthoseinthecontrolgroup,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P0.05).Aftertransfection of A549 cells with siRNA,the expression of Gal-4 protein in the experimental group was lower than that in thecontrol group,and the difference was statistically significant(P0.05).After downregulating the expression of Gal-4 in A549cells,the proliferative ability of the experimental group was lower than that of the control group,and the difference wasstatistically significant(P0.05).After downregulating the expression of Gal-4 in A549 cells,scratch healing in theexperimental group was slower than that in the control group,and the difference was statistically significant(P=0.043).Afterdown-regulating the expression of Gal-4 in A549 cells,there was no significant difference in the apoptosis rate between theexperimental group and the control group(P=0.085).Conclusion Gal-4 is highly expressed in NSCLC cells andpromotes the proliferation and migration of NSCLC cells.Key words Galectin-4;Non-smallcelllungcancer;Pro-liferation;Metastasis基金项目四川省科技创新苗子工程资助项目（2021030）；西南医科大学校级科研项目（2020ZRQNB031）。作者简介罗丹（1989-），女，四川泸州人，硕士，主要从事肺部肿瘤的诊治及研究。通讯作者13论著中国当代医药2023年1月第30卷第3期CHINA MODERN MEDICINE Vol.30 No.3 January 2023肺癌是癌症相关性死亡的最常见原因，是影响全球数百万人生命安全的严重公共卫生问题1。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常见的病理类型，约占 85%2。随着诊疗技术的进步，NSCLC 诊治水平得到不断提高，但因其具有发病隐匿、转移率高、进展快等特点，导致该病预后仍极差，5年生存率不足 20%3-4。因此，深入研究 NSCLC 发生发展的分子机制，积极寻找用于 NSCLC 早期诊断的生物学标志物及有效治疗靶点是 NSCLC 治疗取得突破性进展的关键所在。半乳糖凝集素 4（galectin-4，Gal-4）是-半乳糖家族成员之一，广泛表达于多种生物体内，参与细胞增殖、黏附、凋亡及肿瘤发生发展等过程5。目前Gal-4 在消化道中的研究较为深入，在肺癌中研究甚少，仅少量文献报道 Gal-4 在淋巴结转移的肺腺癌及肺泡癌中高表达，可作为不良预后的预测指标6-7；在前期研究中发现，NSCLC 组织 Gal-4 的表达高于正常肺组织，表达量与病理组织类型相关，在肺腺癌表达量最高8。为进一步明确 Gal-4 在 NSCLC 细胞中的表达及其对肿瘤进程的影响，本研究检测了 Gal-4 mR-NA 及蛋白在 NSCLC 细胞中的表达，通过选取 Gal-4蛋白水平表达最高、最稳定的细胞株转染 siRNA 下调Gal-4 表达，观察 Gal-4 对 NSCLC 细胞增殖、迁徙、凋亡的影响，进一步探讨 Gal-4 在 NSCLC 发生发展中的作用机制。1材料与方法1.1主要试剂和仪器A549、H460、H520、BEAS-2B 细胞及 BEAS-2B培养基（中科院典型培养物保藏委员会昆明细胞库）；胎牛血清、RPMI-1640 培养基（美国 HyClone 公司）；Trizol（北京天根生化科技有限公司）；Rever Tra AceqPCR RT Kit、SYBR Green RT-PCR Master Mix（日本TOYOBO 公司）；Gal-4 兔抗人单克隆抗体（美国 Bi-world 公司）；转染试剂 Lipo6000TM、-actin 兔抗人单克隆抗体、HRP 标记的山羊抗兔 IgG、CCK8 试剂盒、Annexin V-FITC 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；LGALS4-siRNA（上海生工生物工程股份有限公司）；倒置显微镜（日本 Olympus 公司）。1.2方法1.2.1细胞培养用含 1%青链霉素及 10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养基培养 NSCLC 细胞，BEAS-2B专用培养基培养 BEAS-2B 细胞，于 37、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。1.2.2 RT-PCR 将 15107个细胞置于无酶 EP 管中，使用 Trizol 试剂进行总 RNA 提取，测定 RNA 浓度后，用反转录试剂合成 cDNA，GAPDH 为内参，SYBR Green RT-PCR Master Mix 试剂进行 PCR 反应。引物序列 GAPDH（正向）：5-ATGGGGAAGGTGAAG-GTCG-3，（反向）：5-GGGGTCATTGATGGCAACAA-TA-3；Gal-4（正 向）：5-TTGATCTGTCCATTCGCT-GT-3，（反 向）：5-ATGTGTCCACCCTCTGGAAG-3。PCR 扩增反应条件：95 30 s 变性（退火温度 60，延伸温度 72）；95 5 s，55 10 s，72 15 s，循环40 次。采用 2-CT法计算目的基因相对反应起始拷贝数。1.2.3 Western blot 将 1107个细胞置于 EP 管中，以 1 ml/107个细胞的比例加入细胞裂解液，冰上裂解 30 min。4，14 000g，离心 15 min，取上清，BCA 法测定蛋白含量。选择 10%分离胶（Gal-4：36 kDa），