冰片促灯盏乙素透体外血-视网膜内屏障的作用研究_李志林.pdf

2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 冰片促灯盏乙素透体外血-视网膜内屏障的作用研究李志林1，郑祖杰1，黎晓冬1，曾洁萍2（1.成都中医药大学 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院 成都 610075）摘要：目的观察不同比例冰片对灯盏乙素在体外血-视网膜内屏障的促透作用。方法完成高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）检测灯盏乙素药物浓度的方法学开发和验证；体外培养大鼠视网膜血管内皮细胞，并用Transwell建立视网膜内皮细胞屏障模型；在体外血-视网膜内屏障模型的上室中给予含有不同比例冰片的灯盏溶液，分时段提取透屏障后的 HBSS液，采用 HPLC-MS/MS 检测透屏障的下室HBSS液中灯盏乙素浓度。结果自建HPLC-MS/MS检测灯盏乙素的方法特异性好，准确度、灵敏度高，各项方法学验证均符合2015版 中国药典 第四部中 9012生物样品定量分析方法验证指导原则 的要求。建立体外血-视网膜内屏障模型成功，在体外内皮细胞屏障模型中，上室灯盏乙素浓度为100 gmL-1，在2 h后，上室中未添加冰片的下室灯盏乙素药物透过浓度为8.82 gmL-1，上室添加冰片分别为60 gmL-1、120 gmL-1、240 gmL-1、480 gmL-1的下室中的灯盏乙素药物浓度分别为9.50 gmL-1、9.57 gmL-1、11.30 gmL-1、12 gmL-1。在冰片浓度为480 gmL-1时，下室中灯盏乙素的能达到最大浓度为12 gmL-1。结论灯盏乙素在HBSS中的含量检测方法学验证成功；冰片可能具备促进灯盏乙素透体外血-视网膜内屏障模型的作用；在上室的冰片药物浓度达到480 gmL-1时，本研究灯盏乙素透过体外血-视网膜内屏障模型达到最大药物浓度。关键词：高效液相色谱-串联质谱联用 灯盏乙素 冰片 视网膜内屏障doi:10.11842/wst.20210910004 中图分类号:R285.5 文献标识码:A青光眼是以视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）及其轴突进行性丢失为病理基础的神经变性性疾病，临床上青光眼的主要治疗措施是降低眼压，但临床发现某些眼压得到有效控制的青光眼患者，仍然存在视功能继续受损的情况，单纯控制眼压无法遏止RGCs凋亡1。故如何在眼压控制后继续对视神经保护成为国内外研究热点，在既往研究中已有采用各种中药对视神经保护的研究，诸如枸杞多糖、雷公藤、白藜芦醇等2。也有研究证实活血通络中药如灯盏细辛提取物对急性眼内压升高的大鼠RGCs具有确切的保护作用3-4。同时临床上研究表明灯盏花素注射液对于部分青光眼滤过术后患者的视野有部分改善作用5，然而口服制剂（灯盏花素片）临床却未达到预期效果，这可能是因为口服很难透过血眼屏障而在眼内达到有效浓度，注射给药方式又难以长期持续给药从而临床疗效不理想有关。口服药品经吸收后通过血液到达全身，想要进入视网膜内，需要首选通过血-视网膜屏障。既往研究发现冰片作为中医外科的常用药，可经眼、皮肤等部位吸收6。张瑞涛等7研究表明，经鼻腔将冰片给药可 收稿日期：2021-09-10 修回日期：2022-03-06 国家自然科学基金委员会面上项目（81973911）：开窍活血通络法对高眼压大鼠RGCs膜通道及内质网应激-线粒体凋亡途径的多靶点调控研究，负责人：曾洁萍。通讯作者：曾洁萍，副主任医师，主要研究方向：中医药治疗眼底疾病。4260 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价明显提高鼻腔黏膜血管和脑血管的通透性，在一定浓度范围内，伊文思蓝（Evans blue，EB）的通透性与冰片使用浓度呈线性关系。而血-视网膜屏障由内屏障和外屏障组成：内屏障由视网膜毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接构成。因此本研究通过构建内屏障模型观察冰片对药物的促透过作用。1 HBSS中灯盏乙素含量测定方法学建立 1.1实验仪器及药物1.1.1实验仪器API4000型 HPLC-MS/MS 仪（ABSCIEX 公司），十万分之一电子分析天平（SHIMADZU 公司），H2050R低温高速离心机（湖南湘仪），EKUP-II-150L型超纯水仪（四川宜科），多规格可调移液器（Sartorius）；实验药品灯盏乙素（纯度98.54%），批号AF8051821；冰片，批号 AF8040412；黄芩苷（纯度 99.31%，内标），批号AF9062402，均购自于成都埃法生物科技有限公司。实验用甲醇、甲酸、乙腈均为HPLC级。实验中所用纯水为超纯水。1.1.2测定对象灯盏乙素 CAS#：27740-01-8；分子式：C21H18O12；分子量：462.36。黄芩苷CAS#：21967-41-9；分子式：C21H18O11；分子量：446.361.2检测方法1.2.1色谱条件HPLC-MS/MS 系统由 Aglient 公司 1260 型 HPLC仪和AB SCIEX公司API 4000型三重四极杆串联质谱（ESI离子源）组成。选择 Agilent ZORBAX C18色谱柱（2.1e100 mm，3.5 m，批号 959793-902），柱温 30。流动相 A为0.1%的甲酸溶液，流动相 B为0.1%的乙腈溶液。梯度洗脱（见表1）。1.2.2质谱条件以选择性负离子对监测模式（MRM）测定灯盏乙图1灯盏乙素质谱product碎片离子扫描图（m/z 461.3/285.2）表2质谱参数药物成分名称灯盏乙素黄芩苷DP-78-68EP-6-6CE-32-20CXP-18-19CUR1111TEM500500表1梯度洗脱流动相序号012345Total time/min0.002.002.203.403.604.60Flow rate/Lmin-1400400400400400400A/%15.015.095.095.015.015.0B/%85.085.05.05.085.085.04261 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 素（m/z 461.3/285.2）的浓度，黄芩苷作内标（m/z 445.1/268.9），质谱参数见表2，灯盏乙素质谱product碎片离子扫描图见图1，黄芩苷质谱product碎片离子扫描图见图2。1.2.3样本预处理取待测样本 10 L，加入 0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15 85的溶液 90 L，混匀后，再加入50 L内标工作液（1000 ngmL-1的黄芩苷甲醇溶液），混匀后于 4、12000 rmin-1离心 5 min 后，取上清液50 L上样，进样5 L分析。1.2.4数据处理采用 Analyst 色谱工作站，自动计算待测成分与内标的峰面积、峰面积比值、标准曲线、测定浓度以及偏差。浓度单位为 ngmL-1，标准曲线加权设置为1/c2。以标准曲线进样后的色谱峰面积比值对应其理论浓度建立标准曲线方程，未知样本进样后得到的色谱峰面积比值代入次标准曲线方程即可反算出其浓度。1.3方法学验证1.3.1标准曲线先用天平称取灯盏乙素 10.15 mg 标准品，相当于灯盏乙素 10 mg，用甲醇配制灯盏乙素储备液（100 gmL-1），储存条件-35冰箱。取储备液，临用前先用流动相即0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15 85溶液稀释出标准曲线系列工作液STA-STG。基质标准曲线范围为 5000-400 ngmL-1，最低定量限为400 ngmL-1，标准曲线工作液具体配置见表3，标准曲线见图3。1.3.2准确度和精密度用甲醇配制灯盏乙素质控储备液（200 gmL-1）并用50%甲醇水溶液稀释出质控工作液HQC、MQC、LQC（含灯盏乙素4000、2000、400 ngmL-1）。取这3个浓度水平的质控基质样本，经预处理后进样。共测定3个分析批，每批每个浓度各测定6次，计算准确度和精密度。批内精密度 CV 0.91%-1.59%，批间精密度CV 3.70%-7.58%，准确度为98.03%-99.87%。表3标准曲线工作液配制表配置步骤工作液配制取用量加流动相量工作液浓度/ngmL-1）SA取储备液0.25 mL4.75 mL5000SB0.8 mLSA0.2 mL4000SC0.4 mLSB0.1 mL3200SD0.2 mLSB0.2 mL2000SE0.2 mLSC0.2 mL1600SF0.2 mLSE0.2 mL800SG0.2 mLSF0.2 mL400图2黄芩苷质谱product碎片离子扫描图（m/z 445.1/268.9）4262 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价1.3.3预处理回收率取HQC、LQC质控基质样品各3份，经预处理挥干后复溶进样。另取空白HBSS基质经预处理后挥干，加入标准工作液复溶，配制成同理论浓度的样品直接进样，比较两组样品的峰面积，计算预处理回收率。灯盏乙素的预处理回收率为97.3-99.5%，内标的预处理回收率为98.7%。1.3.4特异性与基质效应取6个不同来源未混合的空白HBSS基质，经预处理后分别进样检测，考察空白基质对待测物和内标的出峰干扰情况，结果均未发现干扰。灯盏乙素和内标的保留时间为1.5 min，空白基质图见图4，标准曲线图谱见图5，实测样本图见图6。将6个不同来源的空白HBSS基质经预处理后挥干，加入标准工作液复溶分别配制HQC、LQC两个浓度水平的基质效应考察样本，进样。另配制同理论浓度的纯溶液样本，进样。比较两组样品的峰面积，考察基质效应。每个浓度平行测定3份，计算经内标校正后的基质效应因子，结果各基质的内标归一化基质效应因子分别为0.989-1.003，符合要求。1.3.5稳定性分别考察了储备液和工作液于-30保存31天的稳定性（偏差为（-0.60%）-（-0.84%）、储备液和工作液于室温保存 24 h 的稳定性（偏差为（-3.30%）-图4空白基质图谱（Blank HBSS）图3标准曲线图4263 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11（-0.57%）、基质样本室温保存 22 h 稳定性（偏差为（-1.83%）-（3.53%）、基质样本在-30冰箱冷冻保存60天的稳定性（偏差为（-0.75%）-（-4.05%）、基质样本 反 复 冻 融 5 次 的 稳 定 性（偏 差 为（-1.37%）-（5.33%）、处理后的样本重复进样稳定性（偏差为（1.21%）-（2.34%）和在进样室（11）保存24 h的稳定性（偏差为（-0.96%）（4.27%），其结果均符合要求。1.3.6其他我们还考察了仪器的进样携带污染率（Carryover）、样本稀释的可靠性（稀释系数 5、10）等，其结果均图5标准曲线图谱（SD sample）图6实测样本图谱（Unknown sample）4264 Modernization of Traditional Chinese