2023年百日菊白粉菌的分子检测与鉴定.docx

天道酬勤 百日菊白粉菌的分子检测与鉴定 刘闰 周暄 邢帅 ：对百日上的白粉菌进行分子生物学分析，采用试剂盒法提取病原菌总基因组DNA，PCR扩增其rDNA内转录间隔区〔internal transcribed spacer，简称ITS〕的保守序列并测序，并通过Clustal与MEAG软件构建系统发育树推演系统进化关系，在分子水平鉴定该菌种并比拟与其他白粉菌菌种的亲缘关系。结果说明，本研究测序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列与发生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum〔KF453969.1〕相似度到达99%，与其具有比拟近的亲缘关系。以百日菊白粉菌为研究对象，在分子水平鉴定该菌种并分析其进化亲缘关系为本试验的创新之处。 关键词：百日菊;白粉菌;内转录间隔区;序列分析 中图分类号：S435.672  文献标志码： A  文章编号：1002-1302〔2023〕06-0098-06 百日菊〔Zinnia elegans Jacq.〕别称百日草，为中药材，以全草入药。百日菊也是一年生草花主栽品种之一，其色彩丰富，花大、艳丽，花期长达百日，故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常见的最重要病害之一，在生长区几乎每年都普遍发生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后，最初叶片出现白色粉状斑点，后病斑扩大或相连成片，发病后期叶面布满白色粉层，叶片变褐，严重影响欣赏价值，甚至导致植株成片死亡。发病后期在发病部位形成的小黑点即为病菌的闭囊壳。据以前的研究报道有2个属的白粉菌引起百日菊的白粉病，分别是白粉菌属〔Erysiphe〕和单丝壳属〔Sphaerotheca〕，属于子囊菌门〔Ascomycota〕白粉菌目〔Erysiphales〕，白粉菌科〔Erysiphaceae〕[4-7]。 白粉菌传统的鉴定以其形态学为主要特征，如有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目，闭囊壳外附属丝的特征等，但传统的分类特征有诸多缺乏之处[8-11]。近年来，分子生物学在植物病害鉴定上的应用越来越广泛，特别是植物病原菌在rDNA的内转录间隔区〔internal transcribed spacer，简称ITS〕既具有保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列的特点，通过特异性引物对ITS区段进行PCR扩增，可用于快速鉴定、检测植物病原菌以及病害的诊断等[12-13]。目前国内关于百日菊白粉病病原菌分子分类系统的研究未见报道，通过提取百日菊白粉菌总基因组DNA，利用分子生物学技术对其分类特征及进化关系进行研究，可为该花卉白粉病的准确调查提供有效和实用的手段。 1 材料与方法 1.1 试验材料 白粉菌样本于2023年8月12日采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学城市实验林场，样品编号为BC180623，寄主植物为百日菊。提取白粉菌基因组DNA的试剂盒购自盛泽生物试剂〔目录号：DP321〕。 1.2 试验方法 1.2.1 样品白粉菌的收集 刀片轻轻刮下叶片外表的菌丝与闭囊壳混合物，放入2 mL离心管中，置于-4 ℃冰箱中保存。 1.2.2 基因组DNA的提取 采用试剂盒法提取百日菊白粉菌基因组DNA：〔1〕取适量白粉菌菌丝放入研钵中，参加液氮充分研磨;〔2〕参加400 μL缓冲液FP1和6 μLRNaseA〔10 mg/mL〕，涡旋振荡 1 min，室温放置10 min;〔3〕参加130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心 5 min，将上清液转移至新的离心管中，重复这一步骤;〔4〕向上清液中参加0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时出现絮状基因组DNA，离心2 min，弃上清，保存沉淀;〔5〕参加700 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复这一步骤;〔6〕开盖倒置，室温晾干10 min，彻底晾干剩余的乙醇;〔7〕参加适量洗脱缓冲液TE，65 ℃水浴 10～60 min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。用琼脂糖凝胶电泳方法检测得到的DNA溶液。 1.2.3 ITS序列PCR扩增 PCR反响的引物采用通用引物ITS1、ITS4[1，13]，PCR反响所用的试剂是PCR Mix。25 μL的反响体系如下：模板DNA 1 μL;PCR Mix 12 μL;ddH2O 10 μL;P1和P2分别为 1 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循环;72 ℃最终延伸10 min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察，检测合格样品进行序列测定与分析。 1.2.5 序列分析 将所得DNA序列输入GenBank进行BLAST比对检索，从NCBI数据库中调取22种白粉菌ITS保守序列，采用Clustalx1.83将测序白粉菌〔BC180623〕结果与不同白粉菌的ITS序列构建系统发育树，推演系统进化关系。 2 结果与分析 2.1 基因组DNA提取与PCR扩增的结果 ITS通用引物扩增获得的目的片段用胶回收试剂盒回收并纯化，对所得结果进行电泳检测〔图1〕，PCR扩增产物在回收后送生工生物工程〔上海〕股份测序，测序获得长度为603 bp的碱基序列，结果如下：2.3 百日菊白粉菌ITS序列进化樹构建结果与分析 获得的序列用NCBI的BLAST进行序列搜索，从GenBank中选取局部植物白粉菌ITS序列与本试验测序结果进行比拟分析〔表1〕。对表1白粉菌的ITS序列比照分析结果见图2。 由图2可知，样品百日菌白粉菌BC180623的ITS序列与KF453969.1的ITS序列最为接近，相似度到达99%。两者序列差异性主要表达在第2、4、19、560、581、585位碱基上。说明样品百日菊白粉菌与KF453969.1具有较近的亲缘关系。此外，23种白粉菌ITS序列219 ～374 bp之间保存着较高的一致性，因此，这些区段有可能起到了保障白粉菌性状稳定遗传的功能。