6种表面活性剂的生物毒性研究_郑璐.pdf

安全、健康环境环境保护与治理 年第 卷第 期编辑 汪皕喆：种表面活性剂的生物毒性研究郑 璐（中石化安全工程研究院有限公司，山东青岛）收稿日期：作者简介：郑璐，助理工程师，年硕士毕业于大连理工大学环境工程专业，现从事生态毒理学方向的研究工作。基金项目：中国石化科技部项目（），基于芯片的油田新型助剂综合毒性评估技术研究。摘 要：石油工业在发展的中后期，大量使用表面活性剂以提高采收率，但大部分表面活性剂的生物毒性作用尚不明确。以 发光菌、重组大肠杆菌和大肠杆菌为受试微生物，综合研究了 种现役表面活性剂的急性毒性和 毒性作用分级，通过体外凝胶电泳研究了表面活性剂的 损伤和作用机理。结果表明，种表面活性剂均表现出较高的急性毒性，重组大肠杆菌较 发光菌和大肠杆菌更敏感，可能更适合作为生态监测测试菌；种表面活性剂中有 种为高毒，种为有毒，且均能引起质粒 损伤，可能原因为表面活性剂与 直接结合导致，其中 种磺酸型表面活性剂诱导 损伤的毒性较强，推测可能具有一定的遗传毒性。研究结果可为表面活性剂的健康、环境安全性指标和生物毒性的检测方法提供参考。关键词：表面活性剂；发光菌；重组大肠杆菌；大肠杆菌；体外 损伤；生物毒性中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）前言表面活性剂是一类由疏水的非极性基团和亲水的极性基团组成，吸附于水油两界面，降低界面张力，提高界面活性的化学物质。借助表面活性剂可提高石油开采过程中的采收率，按溶于水后的带电性质，可以将表面活性剂分为非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。当前使用较多的有阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂包括磺酸盐类和羧酸盐类，非离子表面活性剂多为聚氧乙烯类。表面活性剂可以和细菌生物蛋白质发生作用，加速蛋白质分子变性，具有杀菌与消毒的作用，在工业行业中应用较为广泛。由于微生物生长变化可以直接反映出环境的受污染程度，因此将微生物作为表面活性剂毒性监测的指示者具有一定的实用价值。但目前针对表面活性剂生物毒性的研究较少，为识别表面活性剂的危害并对其安全使用提供参考，有必要进行表面活性剂的生物毒性研究。生物毒性实验是利用敏感生物检测受试样品的毒性影响，评估表面活性剂对环境的毒性危害和潜在污染，是环境保护的有效手段之一。急性生物毒性实验可探明环境污染物与机体短时间接触后所引起的损害作用，可为环境污染提供预警，。发光细菌法是一种有效的急性毒性检测方法，快速、灵敏、简便且廉价，在有毒物质的筛选以及环境污染生物学评价等方面有重要应用。发光细菌在新陈代谢过程中能发出波长为 左右的蓝绿色光（荧光），体内 含量与发光强度呈正比。加入有毒物质后，处于活跃期的发光细菌会受到抑制甚至死亡，体内的 含量也会随之降低甚至消失，发光度将下降甚至到零。年，我国国家环保局（即生态环境部）公布了关于发光细菌法监测水质毒性的国家标准水质 年第 卷第 期环境保护与治理 急性毒性的测定 发光细菌法（）。但发光细菌法易受样品色度、浊度和盐度的干扰，而以大肠杆菌为测试菌时可规避这些问题，毒性分析结果更客观真实，且成本更低，检测范围更宽，适用于大批量的化合物和样品初筛。基于基因工程技术，用含有发光基因（）的质粒构建重组发光工程菌，其反应原理与发光细菌类似。重组工程菌在毒性污染物检测、保存和运输过程等方面均非常稳定，。生物毒性实验结果可用于进行污染物或化学品的生物安全评价。常用的方法有潜在毒性法、潜在生态毒性效应指数法和毒性单位分级评价法等。开展潜在毒性实验时，需将水样稀释 次，然后循环进行毒性实验，直到测试的水样无毒。该方法虽然简单方便，但只采用了一项生物毒性实验，缺乏代表性。，等利用潜在毒性效应指数法评价水体毒性，但该方法需考虑水体排放量，不适合进行化学品的生态安全评价。，等提出的毒性单位分级评价方法可根据生物毒性实验结果，基于毒性分级体系，进行污染物的安全性评价。该方法可综合利用多种生物毒性实验结果，适用于评价表面活性剂的生物毒性。表面活性剂作为职业暴露人群在操作环境中经常接触的化学品，具有致突变性，故研究其在环境致突变中的作用十分必要。遗传物质 的改变会诱发突变，本文通过体外凝胶电泳实验研究表面活性剂对质粒 的损伤作用，进而评价和预测化学品对人体可能造成的危害。本文以 发光菌、重组大肠杆菌和大肠杆菌为受试微生物开展急性毒性实验，由于 发光菌和重组大肠杆菌发光强度的减弱以及大肠杆菌存活数量的降低，均由表面活性剂的暴露所引起，存在明确的剂量效应关系。通过毒性单位分级评价方法对表面活性剂的一般急性毒性进行综合评价，并从特殊毒性研究了其对体外 分子的损伤效应，为表面活性剂的危害识别、安全使用及环境健康安全性指标提供支撑和参考。材料与方法 试剂材料与仪器磷酸氢二钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、磷酸氢二钠（生化专用，北京百灵威科技有限公司）、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甘油（用于生化，北京百灵威科技有限公司）、酵母提取粉（生化试剂，北京百灵威科技有限公司）、琼脂粉（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）、胰蛋白胨（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）、培养基（用于生化，生工生物工程（上海）股份有限公司）、七水合硫酸锌（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、过硫酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、染料（碧云天生物技术）、上样缓冲液（碧云天生物技术）。超净工作台（，新加坡）；高压蒸汽灭菌器（，日本）；生化培养箱（，德国）；电泳槽（北京六一生物科技有限公司，中国）；多功能酶标仪（，美国）。供试生物 发光菌供试发光细菌为滨松光子 冻干粉，明亮发光杆菌（），好养菌，安瓿瓶包装，每瓶.，置于 、空气摇床复苏培养。大肠杆菌供试大肠杆菌为大肠埃希氏菌冻干粉（），编号为，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，好氧菌，置于 、空气摇床复苏培养。重组大肠杆菌稳定发光的重组大肠杆菌为稳转 低拷贝质粒的 ，质粒携带 基因，购自，好养菌。质粒质粒 购自 ，货号为。供试药剂以某工厂注聚大队化学驱 号注聚站现役的 种表面活性剂为供试药剂进行毒性研究，化学驱重点实验室主要开展聚合物驱、三元复合驱、二元复合驱和非均相复合驱等驱油技术的研究，其中氟碳表面活性剂和磺酸盐表面活性剂的应用最为广泛。供试药剂相关信息见表。郑璐 种表面活性剂的生物毒性研究安全、健康环境环境保护与治理 年第 卷第 期 表 种待试药剂性质试剂名称性状（颜色、浊度及黏稠度）氟碳表面活性剂 淡黄色黏稠氟碳表面活性剂 极浅黄色黏稠氟碳表面活性剂 极浅黄色微黏稠氟碳表面活性剂 极浅黄色微黏稠磺酸盐表面活性剂 黑色不透明黏稠磺酸盐表面活性剂 黑色不透明黏稠 实验方法 发光菌急性毒性实验参考 开展样品对 发光细菌的急性毒性实验。实验前，复苏 发光细菌，传代备用。表面活性剂分别设置 个不同的浓度梯度，每个梯度 个平行，实验样品均使用灭菌的 溶液进行梯度稀释。采用白色不透明的 孔微孔板，每孔加入 待测样品和 发光菌溶液 ，迅速置于（）板式摇床混匀 ，使用 多功能酶标仪化学发光模块进行相对光单位测定。大肠杆菌急性毒性实验实验前，复苏大肠杆菌，传代备用。表面活性剂分别设置 个不同的浓度梯度，每个梯度 个平行，实验样品均使用灭菌的蒸馏水进行梯度稀释。采用透明 孔微孔板，每孔加入 或 待测样品以及相应的大肠杆菌溶液 或 ，对照组相应加入 或 的蒸馏水，使其终体积为 。实验孔四周用 蒸馏水液封，封口膜沿 孔板四周缝隙密封，放置于、的摇床中培养 ，随后于 多功能酶标仪中检测，检测前振荡 ，在 处测得其吸光度。重组大肠杆菌急性毒性实验实验前，复苏重组大肠杆菌，传代备用。表面活性剂分别设置 个浓度梯度，每个梯度 个平行，实验样品均使用灭菌的.溶液进行梯度稀释。采用白色不透明 孔微孔板，每孔加入 待测样品和重组大肠杆菌溶液 ，迅速置于（）板式摇床混匀 ，使用 多功能酶标仪化学发光模块进行相对光单位测定。损伤实验分别加入一定浓度的表面活性剂、过硫酸铵（，）和 于 孵育 ，冰浴终止反应，加入溴酚兰上样缓冲液并立即电泳。采用水平凝胶电泳，先将 琼脂糖 溶于 缓冲溶液，待温度降至约 时加入.染料，上样，电泳 ，扫描电泳结果并采集图像。毒性等级划分采用急性毒性单位（）表征表面活性剂的生物毒性，根据，等提出的毒性分类系统，急性毒性效应分为 级，分别为：无毒.，微毒.，有毒，高毒，剧毒。分别对每种菌、每种表面活性剂的 值单独计算，并计算每种表面活性剂关于 种菌 的几何平均数得到（综），用以表征每个表面活性剂的综合毒性，（综）的计算如式（）所示。（综）（发光菌）（重组大肠杆菌）（大肠杆菌）（）统计分析数据结果用平均值 标准误差表示，采用 统计分析软件（）进行单因素方差分析（）。“”表示 组之间有显著差异（.）；“”表示 组之间有极显著差异（.）。表面活性剂生物毒性的剂量效应关系用非线性函数表示，选择 软件中的 回归分析且以 函数进行非线性拟合。结果 种表面活性剂对 发光菌的急性毒性 选用氯化汞作为毒性参照物，但氯化汞为国家控制剧毒化学品，危害人体健康和生态环境，不易购买。因此，实验依据 标准方法要求，选择了易溶、稳定、常见、价廉且对人体和环境危害小的 作为 年第 卷第 期环境保护与治理 毒性参照物。阳性质控 的 值为.（图），基本符合美国标准方法的规定（的 值为 ）。根据预实验结果，分别确定了 种表面活性剂 值的浓度范围；种表面活性剂对 发光菌的活性抑制具有持续增强的剂量效应关系，发光菌的相对发光率随 种表面活性剂浓度的增加而降低，表面活性剂的毒性大小与浓度呈正相关。图 结果表明，种表面活性剂对 发光菌均具有抑制作用。其中，表面活性剂 和 对 发光菌的急性毒性最高，值分别为.和.；其次为表面活性剂、和，值分别为.、.和.；表面活性剂 对 发光菌的急性毒性最低，值为.。图 种表面活性剂对 发光菌的毒性作用 种表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性重组大肠杆菌急性毒性实验中，阳性参照物的 值为.（图），低于 发光菌，表明重组大肠杆菌的灵敏度高于 发光菌。种表面活性剂对重组大肠杆菌的发光强度具有不同程度的抑制作用，除表面活性剂 在低浓度组发光强度略有增加外，其余表面活性剂的发光强度均随暴露剂量的增加而降低。其中，表面活性剂、和 对重组大肠杆菌的急性毒性较高，值分别为.、.、.、.和.；表面活性剂 对重组大肠杆菌的急性毒性相对较低，为.，这与表面活性剂 对 发光菌具有相对较低的急性毒性结果是一致的，但 种表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性远高于 发光菌。种表面活性剂对大肠杆菌的急性毒性表面活性剂暴露于大肠杆菌 后，表面活性剂 表现出显著的急性毒性效应，对大肠杆菌的生长抑制随浓度的升高而增强。表面活性剂 的 值 分 别 为.、.、.和.；而表面活性剂 和 并未观察到对大肠杆菌的急性毒性作用，如图（因表面活性剂 和 的样品稀释浓度范围跨度较大，为能更直观的表现其毒性作用趋势，故横坐标取对数）。郑璐 种表面活性剂的生物毒性研究安全、健康环境环境保护与治理 年第 卷第 期 图 种表面活性剂对重组大肠杆菌的毒性作用图 种表面活性剂对大肠杆菌的毒性作用 综合毒性对于 发光菌，表面活性剂 的毒性作用最低，毒性分级为有毒，值为.（表）；表面活性剂 的毒性最高，为剧毒，值为.，是表面活性剂 的.倍，各表面活性剂对 发光菌的急性毒性由大到小依次为表面活性剂 年第 卷第 期环境保护与治理 。重组大肠杆菌与 发光菌的结果类似，表面活性剂 的毒性最低，为高毒，值为.；表面活性剂 和 的毒性最高，为剧毒，值均约为.，是表面活性剂 的.倍，各表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性由大到小依次为表面活性剂 。对于大肠杆菌，表面活性剂 对其毒性均为高毒。通过计算 种菌对各表面活性剂 值的几何平均数进行综合毒性分级，发现 种表面活性剂均表现出了较高水平的综合急性毒性，其中表面活性剂 为有毒，表面活性剂 为高毒。各表面活性剂的综合急性毒性由高到低依次为表面活性剂。表面活性剂诱导体外 断裂损伤效应质粒 为超螺旋双链环状，受到氧化等损伤时可引起 单