2种丹参酮Ⅱ_A-黄芪甲苷...的制备及体外抗肿瘤活性比较_李霞.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目（）；江苏省中医药科技发展专项（）通信作者陈彦，博士，研究员，博士生导师，研究方向为中药新制剂、新剂型研究，：作者简介 李霞，硕士研究生，：种丹参酮黄芪甲苷共载纳米给药系统的制备及体外抗肿瘤活性比较李霞，郭弘，毛登烜，刘玉萍，陈彦，（南京中医药大学 附属中西医结合医院，江苏 南京；江苏省中医药研究院 中药组分与微生态研究中心，江苏 南京）摘要 筛选用于共载丹参酮、黄芪甲苷的优良载体，构建用于抗肿瘤的丹参酮黄芪甲苷纳米给药系统。采用水滴定法制备丹参酮黄芪甲苷微乳（，）；水热法合成金属有机骨架（，），被动载药法制备丹参酮黄芪甲苷 纳米递送系统（）；采用动态光散射（）、透射电镜（）、扫描电镜（）表征二者理化性质，测定二者载药量，法比较二者对血管内皮细胞、淋巴细胞和肝癌细胞增殖能力的影响。结果显示，的粒径、电位、载药量分别为（.）、（.）、.；的粒径、电位、载药量分别为（.）、（.）、.，相较于，载药量更高，且在更低质量浓度下即可抑制 内皮细胞增殖，并能够显著提高 细胞的增殖能力。因此，优选 作为共载丹参酮、黄芪甲苷的载体。关键词 丹参酮；黄芪甲苷；微乳；金属有机骨架（）；纳米制剂；抗肿瘤 ，（，；，）（）（）.（）.（）.（），（），（）.，.，（.），（.），（.），（.），（.），.，.，李霞等：种丹参酮黄芪甲苷共载纳米给药系统的制备及体外抗肿瘤活性比较 ；（）；：.肝癌是全球发病率第六和病死率第三的癌症，其在我国每年的新发病例和死亡病例均居全球第一。肝癌组织中的异常血管会导致抗肿瘤药物和免疫细胞向肿瘤内部浸润受阻，同时，肝癌微环境中 等免疫抑制因子也降低了浸润性免疫细胞的抗肿瘤活性。因此，促进肿瘤血管正常化的同时增强免疫细胞活性，将有助于增强抗肿瘤药物的疗效。丹参黄芪是临床用于治疗肝癌的中药复方中常用的药对。现有文献表明，丹参中的丹参酮（，）具有促进肿瘤血管正常化的作用，黄芪中的黄芪甲苷（，）具有提高免疫细胞抗肿瘤活性的作用。将二者共同递送于肿瘤微环境中，可发挥协同改善免疫微环境的作用，将有助于增强抗肿瘤药物的疗效。然而，二者均为难溶性药物，体内递送面临挑战。微乳（，）是一种由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂混合自发形成的热力学稳定体系，可改善药物溶解度并实现多种难溶性成分的共载。金属有机骨架（，）是一类由无机金属与有机配体组成的新兴纳米载体，可同时荷载不同性质的成分。基于上述 种纳米载体均有共载 和 潜力的特点，本文尝试构建了共载 和 的 及 给药系统，通过比较 种制剂的粒径、电位、载药量等理化性质，及二者对血管内皮细胞、淋巴细胞和肝癌细胞的作用，筛选适合 和 体内共递送的优良载体，旨在为 和 共载新制剂的研发提供研究基础与思路。材料小鼠内皮细胞 、小鼠 淋巴细胞、小鼠肝癌细胞 均购自中国科学院上海细胞库。丹参酮（批号，纯度）、黄芪甲苷（批号，纯度）（上海源叶生物科技有限公司）；辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯、甘油三乙酸酯、丙烯酸钠盐（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯、甘油三丁酸酯、甘油三油酸酯、辛酸葵酸甘油三酯（）、聚乙二醇（）、聚乙二醇（）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；聚氧乙烯 氢化蓖麻油（）、聚乙二醇 羟基硬酯酸酯（）、聚氧乙烯 蓖麻油（）分析纯，巴斯夫（中国）有限公司；甘油三丙酸酯、六水合三氯化铁（）、二乙二醇（分析纯，阿拉丁试剂有限公司）；硝酸、氢氟酸、无水乙酸钠（分析纯，南京化学试剂有限公司）；均苯三甲酸（分析纯，上海易恩化学技术有限公司）；乙腈（色谱纯，美国 公司）；试剂盒（批号，日本同仁化工有限公司）。型十万分之一天平、型百万分之一天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；型万分之一天平（上海良平仪器仪表有限公司）；型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；型 蒸发光散射检测器（奥泰医疗系统有限责任公司）；型气浴恒温恒速振荡器（江苏金坛金城国胜实验仪器厂）；型数显恒温搅拌水浴锅（金坛区西城新瑞仪器厂）；型高温烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；型聚四氟水热釜（上海霍桐实验仪器有限公司）；型机械搅拌仪（美国塞洛捷克公司）；型高速冷冻离心机、型酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；型超纯水设备仪（公司）；型粒径仪（马尔文仪器公司）；型扫描电子显微镜（卡尔蔡司光学有限公司）；型透射电子显微镜（飞利浦公司）。方法.高效液相色谱条件 测定条件：依利特 色谱柱（.，）；流动相为乙腈水 ，等度洗脱；流速.；检测波长；柱温；进样量 。测定条件：依利特 色谱柱（.，）；流动相为乙腈水 ，等度洗脱；流速.；柱温；进样量。漂移管温度 ；载气流速.；增益系数。年 月第 卷第 期.，.，.丹参酮黄芪甲苷微乳（，）的制备.、在辅料中溶解度的测定 采用平衡溶解度法测定、在辅料中溶解度，分别取过量的、加入到油相（肉豆蔻酸异丙酯、甘油三丁酸酯、甘油三油酸酯、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯、甘油三乙酸酯、甘油三丙酸酯）、表面活性剂（、）、助表面活性剂（、）中，涡旋混合 ，超声 。置于 气浴恒温振荡器 振荡 ，平衡后，、离心 ，取上清液用甲醇稀释 倍，混匀，过.有机相微孔滤膜，按照 项下色谱条件测定，记录峰面积并计算 和 的含量，计算、在不同油相、表面活性剂、助表面活性中的溶解度。.混合油相的选择以甘油三丙酸酯和油酸乙酯 作 为 混 合 油 相，以 为 表 面 活 性 剂，为助表面活性剂，将甘油三丙酸酯与油酸乙酯按照不同质量比（、）混合，将 和 以 的质量比混合作为混合表面活性剂，油相与混合表面活性剂按照不同质量比（、）混合，构建伪三元相图，通过伪三元相图面积筛选出最佳的油相配比。.表面活性剂与助表面活性剂质量比（）的选择 以甘油三丙酸酯和油酸乙酯作为混合油相，为表面活性剂，为助表面活性剂，将甘油三丙酸酯与油酸乙酯按照 的质量比混合，将 和 按照不同质量比（、）混合，油相与混合表面活性剂按照不同质量比（、）混合，构建伪三元相图，通过伪三元相图面积，筛选出最佳的。.处方的优化 以甘油三丙酸酯和油酸乙酯作为混合油相，以 为表面活性剂，为助表面活性剂，将甘油三丙酸酯与油酸乙酯按照 的质量比混合，将 和 按照 的质量比混合，油相与混合表面活性剂按照不同质量比（、）混合，加入 与，两者质量比为 ，、磁力搅拌下将 注射用水逐滴加入到体系中乳化，通过改变丹参黄芪组合物的投药量直至药物析出，确定 的最佳处方。.制备方法验证 取甘油三丙酸酯油酸乙酯混合物 ，.，.于西林瓶中，、搅拌过夜，随后将 注射用水逐滴加入到体系形成澄清透明液体，即得。.基 的制备.的合成 根据文献，取无水乙酸钠.于圆底烧瓶中，加入 二乙二醇，室温、机械搅拌 ，再加入丙烯酸钠.，室温、机械搅拌 ，最后加入.，室温、机械搅拌，将搅拌均匀的溶液转移至安瓿瓶中，反应 ，离心，取沉淀即得 纳米粒。.基 载体制备方法的优选方法：取 纳米粒，与 均苯三甲酸（，）溶 于 含.硝酸和.氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，反应 ，离心，取沉淀即得。方法：取 纳米粒，溶于 水中，加入 和 ，于反应釜中，反应 ，离心，取沉淀即得。方法：取 纳米粒，于 水浴下，先加入 的.乙醇溶液，机械搅拌 ，溶液 离心 ，沉淀于 水浴下再次加入 的.乙醇溶液，机械搅拌 ，离心 ，取沉淀。重复上述循环 次，将沉淀与 和 共溶于 乙醇中，封入反应釜中，反应 ，离心，取沉淀即得。分别取方法、所得沉淀 ，用纯水稀释至 ，采用马尔文粒度仪测其粒径电位，筛选最佳制备方法。.、共载投药配比的考察 将 活化 后，与、按照不同的质量比（、.、）置于甲醇中，室温、避光机械搅拌 ，离心收集上清。按照.项下色谱条件测定不同质量比下、的载李霞等：种丹参酮黄芪甲苷共载纳米给药系统的制备及体外抗肿瘤活性比较药量，筛选二者最佳配比。.共载 基（）制备 将 活化 后，与、按照.项下筛选的质量比置于甲醇中，室温、避光机械搅拌 ，离心，沉淀 真空干燥，即得。.种制剂理化性质的比较.动态光散射（，）分别测定 和 的粒径、电位将 和 用纯水稀释至 ，采用马尔文粒度仪测定二者的平均粒径和 电位。.观察 的形貌 取 ，加纯水稀释 倍，取少量微乳液 滴到铜网上，静置 后，用滤纸吸取多余的液体，滴加 磷钨酸溶液，负染 ，烘干，于 下观察。.观察 的形貌取 粉末 ，用无水乙醇稀释至 ，取少量分散于铜片上，样品干燥后喷金于 下观察。.载药量测定 载药量的测定：将 过.有机滤膜，精密量取续滤液 ，冷冻干燥，得冻干物，称重，得 冻干质量。取 ，加入 倍的甲醇破乳，按照 项下色谱条件测定，记录峰面积并计算 和 的含量，即 总。按照载药量总 计算。载药量的测定：将、按质量比溶于甲醇中，得载药前溶液，取 载药前的溶液，按照.项下色谱操作条件测定、的含量，即 总；取适量，称重，得 质量为载体，按照.项下制备，取 载药后上清液，按照.项下色谱操作条件进样，记录峰面积并计算游离 和 的含量，即 游离。按照 载入 总游离，载药量 载入（载入载体）计算。.体外评价取生存状况良好的 、细胞，使用含 胎牛血清的完全培养基调整细胞密度（其中 细胞用 完全培养基，、细胞用 完全培养基）并以 个孔细胞接种于 孔板中。分组如下：空白组、对照组、不同质量浓度（.、.、.、.、.、）的空白、空白 和 给药组（均以制剂质量浓度计），每组设 个复孔，于培养箱培养 ，取出 孔板，每孔加入 试剂，继续孵育.，于 处用酶标仪测定其，按照细胞存活率（实验空白）（对照空白）计算药物对细胞的增殖抑制率。.数据分析所有数据均以?表示，采用 .软件进行数据分析，组间差异采用单因素方差（）分析，.表示差异显著。结果.、在不同辅料中的溶解度采用平衡溶解度法测量、在不同油相、表面活性剂、助表面活性剂中的溶解度，见表。表 丹参酮和黄芪甲苷在不同辅料中的溶解度（?，）（?，）辅料辅料种类溶解度 油相肉豆蔻酸异丙酯.油酸乙酯.油酸.辛酸葵酸甘油三酯.甘油三丁酸酯.甘油三丙酸酯.甘油三乙酸酯.表面活性剂 聚氧乙烯 氢化蓖麻油（）.聚乙二 羟基硬酯酸酯（）.聚氧乙烯 氢化蓖麻油（）.辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（）.助表面活性剂.注：未检出。年 月第 卷第 期.，.，结果显示，对于油相，在不同油相中的饱和溶解度大小依次为甘油三丙酸酯甘油三丁酸酯油酸乙酯甘油三乙酸酯辛酸葵酸甘油三酯肉豆蔻酸异丙酯油酸，而 在上述油相中均不溶，说明 为油水两不相溶性的药物；对于表面活性剂，在不同表面活性剂中的溶解度大小依次为，而 只溶于；对于助表面活性剂，在、中的饱和溶解度相似，在不同助表面活性剂中的溶解度为。综上，为增大药物的溶解度，实现两药共载，选取甘油三丙酸酯为油相、为表面活性剂、为助表面活性剂进一步进行处方筛选。在研究中发现，以甘油三丙酸酯为油相与乳化剂、助乳化剂配伍时无法乳化完全，且乳化时间较长，但添加一定的油酸乙酯可显著减少 的乳化时间，并增加 的稳定性。因此，通过溶解度试验，最终选择甘油三丙酸酯油酸乙酯作为混合油相，为表面活性剂，为助表面活性剂进一步用于处方的筛选。.混合油相的选择利用伪三元相图分别考察甘油三丙酸酯油酸乙酯为、时微乳区域面积的大小，筛选混合油相的最佳配比，见图。；（图 同）。图 不同比例的甘油三丙酸酯与油酸乙酯混合所得伪三元相图 通过伪三元相图可知，当甘油三丙酸酯与油酸乙酯比例为 ，时，制剂的载药量达到最大，乳化效果最好，最终选择甘油三丙酸酯与油酸乙酯质量比为 作为混合油相。.的筛选通过比较 为，时伪三元相图微乳区域面积的大小，确定最佳，见图。由结果可知，当 为 时，其所形成的微乳 图 不同 所得伪三元相图 区域面积最大，体系的稳定性也越好，故选择 为。李霞等：种丹参酮黄芪甲苷共载纳米给药系统的制备及体外抗肿瘤活性比较.处方的确定课题组前期研究结果表明当、的配比为 时，二者具有较好的协同作用；以甘油三丙酸酯，油酸乙酯作为混合油相（），为表面活性剂，为助表面活性剂，加入、，当 的加入量为.，的加入量为.时可形成澄清透明稳定的溶液，因此，确定 处方质量比为甘油三丙酸酯油酸乙酯 为