2株鸡传染性支气管炎病毒株...定及其S1基因遗传进化分析_林裕胜.pdf

林裕胜，刘维巍，张龙，等.2 株鸡传染性支气管炎病毒株的分离鉴定及其 S1 基因遗传进化分析J.福建农业学报，2022，37（11）：13881393.LINYS,LIUWW,ZHANGL,etal.Isolation,Identification,andS1GeneSequencingofTwoStrainsofAvianInfectiousBronchitisVirusJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：13881393.2 株鸡传染性支气管炎病毒株的分离鉴定及其 S1基因遗传进化分析林裕胜1，刘维巍1,2，张龙1,2，江锦秀1，张靖鹏1，刘庆华2，胡奇林1*（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013；2.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）摘要：【目的】了解福建地区鸡传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）的流行及其 S1 基因变异情况。【方法】对 2021 年在福建地区鸡群中分离的 2 株病毒，通过鸡胚致病性试验、电子显微镜观察及 RT-PCR 方法进行鉴定。对 2 株分离株的 S1 基因进行克隆、测序并利用生物学软件进行分析。【结果】分离到的 2 株病毒均为IBV，分别命名为 FJ-NP01 和 FJ-FZ01；FJ-NP01 株和 FJ-FZ01 株的 S1 基因全长分别为 1629nt 和 1620nt，编码 543aa 和 540aa。FJ-FZ01 株的 S1 基因裂解位点为 HRRRR，与基因型 I 分支所有参考毒株裂解位点一致；分离株 FJ-NP01 的S1 基因裂解位点为 HRRKR，与已报道的基因型IBV 分离毒株的裂解位点不同，与基因型参考毒株TC07-2 的裂解位点一致。FJ-NP01 株和 FJ-FZ01 株之间的核苷酸和氨基酸同源性较低，分别为 83.2%和 79.6%；与中国使用的 Mass 型常规疫苗 H120 和 H52 核苷酸和氨基酸序列同源性仅为 75.7%76.3%和 77.1%83.5%。FJ-NP01 株是由基因型毒株 CKCHGDLZ12-4 与基因型 I 毒株 L-1148 在 S1 基因处发生重组而产生的新毒株，其核苷酸序列14381506nt 与推测的亲本毒株 CKCHGDLZ12-4 同源性达 97%，其他 S1 基因核苷酸序列与推测的亲本毒株 L-1148 同源性达 95.9%。【结论】以上结果表明福建地区 IBV 流行较为复杂，现有 Mass 型疫苗在福建省可能起不到良好的免疫保护作用。关键词：鸡传染性支气管炎病毒；分离；鉴定；S1 基因；序列分析中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11138806Isolation,Identification,and S1 Gene Sequencing of Two Strains ofAvian Infectious Bronchitis VirusLINYusheng1,LIUWeiwei1,2,ZHANGLong1,2,JIANGJinxiu1,ZHANGJingpeng1,LIUQinghua2,HUQilin1*（1.Institute of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian350013,China;2.College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350002,China）Abstract:【Objective】Epidemiologyandgeneticvariationsoftheinfectiousbronchitisvirus(IBV)inFujianprovincewerestudied.【Method】TwostrainsofvirusisolatedfromthediseasedchickensinFujianin2021wereidentifiedbychickenembryopathogenicitytest,electronmicroscopeobservation,andRT-PCR.S1genesoftheisolateswerecloned,sequenced,andanalyzedusingbiologicalsoftware.【Result】ThetwoIBVstrainswerecodenamedFJ-NP01andFJ-FZ01.ThefulllengthofS1ofFJ-NP01was1629ntencoding543aminoacids,andthatofFJ-FZ01,1620ntencoding540aminoacids.TheS1genecleavagesiteofFJ-FZ01wasHRRRR,sameasallreferencestrainsofgenotypeIbranch;whilethatofFJ-NP01HRRKRdifferedfromthereportedsiteofIBVisolatedfromgenotypebutsameasthatofTC07-2referencestrainofgenotype.Thehomologyofnucleotideandaminoacidbetweenthetwoisolateswas83.2%and79.6%,respectively,butmerely75.7%76.3%and77.1%83.5%withtheMass-typeconventionalvaccinesH120andH52,respectively.FurtheranalysisshowedthatFJ-NP01wasfromarecombinationeventbetweenCKCHGDLZ12-4andL-1148,thehomologyofnucleotideacidbetween14381506nt收稿日期：20220218初稿；20220902修改稿作者简介：林裕胜（1988），男，硕士，助理研究员，主要从事动物传染病研究（E-mail：）共同第一作者：刘维巍（1999），男，硕士，主要从事动物传染病研究（E-mail：）*通信作者：胡奇林（1963），男，硕士，研究员，主要从事动物传染病学和免疫学研究（E-mail：）基金项目：福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目（XTCXGC2021008）；福建省科技计划公益类专项（2021R1026007）；福建省自然科学基金项目（2021J01484）；福建省农业科学院畜病防控科技创新团队建设项目（CXTD2021007-2）福建农业学报2022，37（11）：13881393http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.003of FJ-NP01 with CK CH GD LZ12-4 was 97%,and 95.9%betweenthe othernucleotide acid of S1 gene with L-1148.【Conclusion】ItappearedthattheIBVepidemicexperiencedintheprovincewascomplexinnatureandthattheexistingMassvaccineswouldnotprovidesufficientimmuneprotectiontodeterthespread.Key words:Infectiousbronchitisvirus；isolation；identification；S1genes；sequenceanalysis0引言【研究意义】鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）感染引起的一种急性、接触性传染性病，被世界兽医局列为禽病 B 类传染病1。根据 IBV 对宿主组织的亲嗜性及引起的主要症状，可将其划分为呼吸系型、肾型和肠型等。IBV 基因型较多且不同类型毒株之间交叉免疫保护的能力弱，导致该病的防控难度较大，至今 IB 仍是妨碍世界养鸡业健康发展的主要疫病之一23。【前人研究进展】IBV 基因组为不分节的单股正链 RNA，全长约27.6kb，囊括 6 种亚基因组mRNA（16），其中mRNA2、mRNA3、mRNA4 和 mRNA6 分别编码 4 个结构蛋白：纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核蛋白（N）47。S 蛋白与宿主细胞膜上的病毒受体结合后被宿主细胞的蛋白酶裂解为 N 端的 S1 蛋白和 C 端的 S2 蛋白4。S1 蛋白是 IBV 产生感染性、致病性及组织嗜性的主要蛋白。不同IBV 毒株间 S1 基因变异较大，其编码的氨基酸差异在 2%25%89。由于 IBV 复制依赖的 RNA 聚合酶缺乏校正能力，以及疫苗的频繁使用，致使病毒在复制过程中容易发生变异或重组1013。S1 基因核苷酸序列的点突变、插入、缺失或重组是导致 IBV 基因型较多的主要原因，国内外学者开展了许多基于S1基因的序列差异分析研究工作1417。国内外学者在 IBV 的病原学、流行与分布、分子遗传变异机制、IBV 诱导的天然免疫应答、体外培养、诊断技术和防控措施等方面都有深入研究。然而，由于IBV 自身变异频率高以及频繁地使用疫苗加剧了野毒株的变异压力，导致病毒进化加快。因此，对IBV 的流行病学和分子遗传变异情况进行监测，已成为有效防控 IBV 的重要组成部分。【本研究切入点】近年来，福建省 IBV 流行发生频繁，2021 年福建地区 IBV 的流行及变异情况亟需开展相关研究。【拟解决的关键问题】在福建地区疑似发生 IB 的临床样品中分离到 2 株病毒，通过对鸡胚致病性试验、电镜观察以及 RT-PCR 进行鉴定确认分离到的2 株病毒均为 IBV，并进一步对 2 株 IBV 分离株的S1 基因进行克隆、测序及序列分析，以期为福建省有效防控 IB 提供科学依据。1材料与方法1.1病料来源、SPF 鸡胚及主要试剂2021 年在福州市、南平市鸡场采集疑似 IB 病死鸡脏器组织样品。10 日龄 SPF 鸡胚购自广东大华农动 物 保 健 品 股 份 有 限 公 司 SPF 实 验 动 物 中 心；IBV 毒株由本研究室分离、鉴定及保存。核酸提取试剂盒（EasyPureviralDNA/RNAkit）、反转录试剂盒（TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix）、克隆试剂盒（pEASY-BluntZeroCloningkit）均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA 纯化回收试剂盒（TianGenUniversalDNAPurificationkit）购自天根生物技术有限公司；高保真酶（2CataAmpHighFidelityPCRMix）购自爱博泰克 生 物 技 术 有 限 公 司；DL2000 DNA Marker购自大连宝生物有限公司。1.2引物设计下载 GenBank 中收录的 IBVS1 全基因序列，利用 Oligo7.0 软件设计 1 对特异性引物，上游引物S1F：5-ACTGAACAAAAGACCGACT-3；下游引物 S1R:5-GGCACTATCATCTTTAACGAAC-3 ，扩增片段大小为 1770bp；IBV 鉴定引物参照参考文献 17 设计，由福州尚亚生物技术有限公司合成。1.3样品处理在生物安全柜中将组织剪碎