miR-320b靶基因预测与鉴定_邸亚男.pdf

中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1 糖尿病分子生物学和遗传学 miR320b靶基因预测与鉴定邸亚男马思思胡涵帅李卫卫张珍珠王晋星一【摘要】目的寻找 miR-320b 靶基因，探讨其参与 T2DM 发生发展的分子机制。方法4 种在线软件 Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS 和 miRmap 预测 miR-320b 靶基因。采用在线软件VENNY2.1 选取 4 种预测结果交集。在线数据库 String 查询靶基因编码蛋白质间的相关性，筛选其候选靶基因。采取全基因合成方式合成野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组 Psicheck-2 质粒载体，Sanger 测序鉴定重组质粒是否构建成功。选取对数生长期 293T 细胞分为 6 组：野生型质粒+miRNA阴性对照组（Psicheck2-PTEN-WT+NC）和野生型质粒+miR-320b mimic 组（Psicheck2-PTEN-WT+mimic）；突变型质粒+miRNA 阴性对照组（Psicheck2-PTEN-Mut+NC）和突变型质粒+miR-320b mimic组（Psicheck2-PTEN-Mut+mimic）；空质粒载体+miRNA 阴性对照组（Psicheck2-NC+NC）和空质粒载体+miR-320b mimic 组（Psicheck2-NC+mimic）。各组进行相应质粒和 miRNAs 共转染，检测双荧光素酶活性。结果4 种在线软件 Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS 和 miRmap 预测 miR-320b 靶基因数分别为 847、1045、806 和 6208，VENNY2.1 取交集后得到 66 个共同靶基因。在线数据库 String显示，66 个靶蛋白之间的相关性主要集中在以人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）为核心的蛋白。双荧光素酶报告基因实验显示，Psicheck2-PTEN-WT+miR320b 组荧光素酶活性比值低于 Psicheck2-PTEN-WT+NC 组（P0.05）。结论miR-320b 作用于靶基因 PTEN 的3 UTR，为探讨 miR-320b 参与 T2DM 发生发展提供依据。【关键词】miR-320b；双荧光素酶报告基因实验；靶基因doi：10.3969/j.issn.1006-6187.2023.01.004The identification of miR320b target gene DI Yanan，MA Sisi，HU Hanshuai，et al.Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Kaili 556000，ChinaCorresponding author：WANG Jinxingyi，Email：【Abstract】ObjectiveTo identify the potential target gene of miR-320b and to explore its molecularmechanism involved in the development of type 2 diabetes mellitus（T2DM）.MethodsFour onlinedatabases，Target Scan，MIRDB，DIANA TOOLS and miRmap，were used for prediction of miR-320btarget genes.The online software VENNY2.1 was used to select the intersection of four prediction results.The online database String was used to identify the relationship among the target gene coding proteins and toscreen the candidate target proteins.The wild and mutant recombinant Psicheck-2 plasmids were synthesized andverifiedbygenesequencingmethods.The293Tcellsweredividedintosixgroups：Psicheck2-PTEN-WT+NC，Psicheck2-PTEN-WT+mimic，Psicheck2-PTEN-Mut+NC，Psicheck2-PTEN-Mut+mimic，Psicheck2-NC+NC and Psicheck2-NC+mimic.Each group was co transfected with corresponding plasmid and miRNAs.The corresponding plasmids and miRNAs were co transfected in each group and the activity of double luciferasewas detected.ResultsThe number of miR-320b target genes predicted by Target Scan，MIRDB，DIANA TOOLS and miRmap software were 847，1045，806 and 6208，respectively.66 common targetgenes were obtained by VENNY2.1 screening.String analysis showed that 66 target proteins were not allcorrelated.The related target proteins mainly belong to PTEN core proteins（phosphatase and tension基金项目：贵州省卫生健康委科学技术基金（gzwkj2021-508、gzwkj2022-264）；黔东南州科技计划项目 黔东南科合支撑（2021）15 号作者单位：556000 凯里，贵州医科大学第二附属医院药剂科（邸亚男、胡涵帅、李卫卫、张珍珠、王晋星一）；北京大学第三医院检验科（马思思）通信作者：王晋星一，Email： 12中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1homologues missing from human chromosome 10）.The dual-luciferase reporter gene system showed that theluciferase activity ratio of psicheck2-PTEN-WT+mimic group was statistically lower than that of psicheck2-PTEN-WT+NC group（P0.05）.ConclusionPTEN is the target gene of miR-320，which mayprovide clues for the mechanism of miR-320b involving in the development of T2DM.【Key words】MicroRNA-320b；Dual-luciferase reporter gene system；Target genemiRNA 是内源性、高度保守的小分子非编码RNA，可通过与 mRNA 的 3 端非编码区结合，抑制 mRNA 翻译或使其降解，从而在转录后控制基因表达1。MiR-320 有调控细胞增殖分化、抗氧化及抗炎症等作用。MiR-320 与多种糖脂代谢疾病相关2-4。血清 miR-320b 在健康人群、T2DM 前期患者及 T2DM 患者中依次降低，与胰岛 细胞功能指数呈正相关，与胰岛素抵抗指数呈负相关5。本研究采用生物信息学技术预测 miRNA-320b 靶基因，进一步采用双荧光素酶实验进行验证，旨在为探讨 miR-320b 参与 T2DM 发生发展提供依据。材料与方法一、实验材料人肾上皮细胞系 293T 细胞株购自 ATCC 公司；胎牛血清（Gibco，10270-106）；Lipo2000（Life，11668019）；DMEM高 糖 培 养 基（Gibco，C11995500BT）胰蛋白酶（Gibco，25200-072）；荧光定量 PCR 仪（ABI，Applied Biosystems）；凝胶成像系统（Tanon 1600，上海天能科技有限公司）；分光光度计（NANODROP2000，Therno scientific）；倒置显微 镜（LEICA，521665）；细 胞 培 养 箱（泰 斯 特，DH3600）；荧光酶标仪（美谷分子，SpectraMaxM5）；Psicheck-2 质粒（Promega，C8021）；野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组 Psicheck-2 质粒载体的构建采取全基因合成方式合成于北京博迈德基因技术有限公司；miR-320b mimics 及阴性对照合成于河马生物科技公司。二、实验方法1.miR-320b 靶基因预测：采用 4 种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS 和 miRmap预测 miR-320b 靶基因。为减少假阳性，采用在线软件 VENNY2.1 选取 4 种预测结果交集，采用在线数据库 String 查询靶基因编码蛋白质间的相互关系。采用在线软件 Targetscan 预测 miR-320b 与靶基因的结合位点。2.双荧光素酶报告基因实验：293T 细胞采用10%胎牛血清 DMEM 高糖培养基，置于 37、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期 293T 细胞以 5000 个/孔接种于 24 孔板，进行双荧光素酶实验。根据双荧光素酶报告基因质粒的不同进行分组，设 置 野 生 型 质 粒+miRNA 阴 性 对 照 组（Psicheck2-PTEN-WT+NC）和野生型质粒+miR-320bmimic组（Psicheck2-PTEN-WT+mimic）；突 变 型 质 粒 miRNA 阴 性 对 照 组（Psicheck2-PTEN-Mut+NC）和突变型质粒+miR-320b mimic组（Psicheck2-PTEN-Mut+mimic）；空质粒载体+miRNA 阴性对照组（Psicheck2-NC+NC）和空质粒载体+miR-320b mimic 组（Psicheck2-NC+mimic）。按质粒 200 ng/孔，NC 或 miR-320b 200 nmol/L 进行共转染。转染后 48 h 检测荧光素酶活性。实验重复 3 次。将 200 l/孔裂解液加入到细胞培养皿中，冰上孵育 5 min，充分裂解细胞。取 20 l 细胞裂解液至黑色酶标板中，加入 100 l 萤火虫荧光素酶反应液，震荡混匀，在荧光酶标仪上检测萤火虫荧光素酶活性；加入 100 l 海肾荧光素酶反应液，震荡混匀，在荧光酶标仪上检测海肾荧光素酶活性。计算各组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值。三、统计学处理采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析。正态分布计量资料以 xs 表示，采用独立样本 t 检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。13中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1结果一、miR-320b 靶基因生物信息预测结果4