北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选_李超楠.pdf

农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2824-28302022年12月李超楠，李洪涛，李运朝，等.北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2824-2830.LI C N,LI H T,LI Y C,et al.Isolation and identification of root rot pathogen of Atractylodes chinensis and screening of biocontrol bacteriaJ.Journal of Agro-Environment Science,2022,41（12）：2824-2830.开放科学OSID北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选李超楠1，2，李洪涛2*，李运朝2，李俊花2，及华2，章丽2，王琳2（1.河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071000；2.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所，石家庄 050051）Isolation and identification of root rot pathogen of Atractylodes chinensis and screening of biocontrol bacteriaLI Chaonan1,2,LI Hongtao2*,LI Yunchao2,LI Junhua2,JI Hua2,ZHANG Li2,WANG Lin2（1.College of Plant Protection,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.Institute of Biotechnology and Food Science,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China）Abstract：To identify the pathogen of root rot of Atractylodes chinensis,pathogenic microorganisms were isolated from the tuber ofAtractylodes chinensis in Chengde,and the pathogenicity of the pathogenic microorganisms was verified via back-grafting.The isolatedpathogenic bacterium with pathogenicity was identified as Fusarium oxysporum.A total of 94 rhizosphere microorganisms were isolatedfrom the rhizosphere soil of healthy medicinal plants,and two biocontrol strains,strain SFJ-27 and strain SFJ-41,were obtained throughplate antagonism screening.Plate antagonism test results showed that the inhibition rates of the two biocontrol strains were above 50%.Itwas identified as Bacillus subtilis and Bacillus velezensis according to molecular biology and morphology.Pot experiments showed that strainSFJ-27 and strain SFJ-41 had significant biocontrol effects on root rot of Atractylodes chinensis,with control effects of 52.27%and 68.19%,respectively.Studies have shown that Fusarium oxysporum can cause root rot of Atractylodes chinensis and Bacillus subtilis and Bacillusvelezensis have preventive effect on the root rot of Atractylodes chinensis.Keywords：Atractylodes chinensis;root rot;Fusarium oxysporum;biocontrol bacillus;medicinal plant收稿日期：2022-11-08录用日期：2022-11-29作者简介：李超楠（1998），男，河北石家庄人，硕士研究生，从事植物病害生物防治研究。E-mail：*通信作者：李洪涛E-mail：基金项目：河北省重点研发计划项目（20326505D，20326421D）Project supported：The Key Research and Development Program of Hebei Province（20326505D，20326421D）摘要：为明确导致北苍术根腐病的病原菌，本实验从承德市感病北苍术块茎中分离病原微生物，并对病原微生物致病性进行回接验证。研究分离获得的具有致病性的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。从健康药用植物根际土壤中分离获得94株根际微生物，通过平板拮抗筛选获得2株生防菌，分别为菌株SFJ-27和菌株SFJ-41，平板对峙实验结果表明2株生防菌抑菌率均在 50%以上。通过分子生物学和形态学鉴定 2 株菌分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）。盆栽实验结果表明，菌株SFJ-27与菌株SFJ-41对北苍术根腐病具有明显的生防效果，防治效果分别为52.27%和68.19%。研究表明，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）可以导致北苍术根腐病的发生，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对北苍术根腐病具有防治作用。关键词：北苍术；根腐病；尖孢镰刀菌；生防芽孢杆菌；药用植物中图分类号：S435.672；S476.1文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2824-07doi:10.11654/jaes.2022-1131北苍术Aractylodis chinensis（DC.）Koidz，别名苍术、山刺、枪头菜，是菊科苍术属多年生草本植物，常以根茎入药1。其主要成分为挥发油、苍术素、-异岩兰烯、糖醛、苍术酮等。北苍术主要具有燥湿健脾，祛李超楠，等：北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选2022年12月风散寒和明目的功效，可以用来治疗脘腹胀满、腹泻和风寒感冒等症状2。近年来，由于市场需求量增加，河北省承德市作为重要北苍术产地，已成为我国北苍术生产的重要基地之一。但是随着人工栽培面积扩大以及种植年限增长，北苍术根腐病病害问题逐年增重，常引起北苍术根茎腐烂和大量死苗，严重影响了北苍术的品质。北苍术作为中药材作物，应减少化学农药的使用，采用生物手段防治北苍术根腐病。因此，为保证北苍术产量和品质，对北苍术根腐病防治进行研究极其重要。当前，有关北苍术根腐病的相关研究较少。为了更好地服务于中药材产业，必须规范中药材种植技术，尤其是病害绿色防控技术，因此对河北省北苍术根腐病防治研究刻不容缓。本研究主要对河北省北苍术根腐病开展防治研究，以期建立更有效的生物防治技术体系。为明确导致北苍术根腐病发生的病原菌，本研究采用组织分离法对河北省承德市北苍术根腐病病原菌进行分离，结合形态学和分子生物学手段对病原菌进行种类鉴定，同时对北苍术根腐病生防菌进行筛选，采用生物防治代替北苍术种植过程中的化学防治，解决北苍术的农药残留问题，进而为开发一种高效、安全的北苍术根腐病防治方法奠定强有力的基础，为北苍术根腐病的防控及北苍术产业的健康发展提供理论基础和科学依据。1材料与方法1.1 供试药剂生物农药对照：10亿cfumL-1枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌（中农绿康北京生物技术有限公司）；化学农药对照：3%甲霜 噁霉灵水剂（河北中保绿农作物科技有限公司）。1.2 实验方法1.2.1 病样采集及病原菌分离2020年在河北省承德市隆化地区采集地上部枯萎的北苍术根腐病病株，用75%乙醇表面消毒，然后使用2%次氯酸钠浸泡2 min，横切根茎部，挑取块茎病健交界部分置于PDA培养基上，28 培养3 d后采用单孢分离法进行纯化3。1.2.2 病原菌形态学鉴定观察纯培养的菌株在 PDA 培养基上的菌落大小、颜色、形态变化，并用显微镜观察菌丝、孢子结构类型，初步对菌株进行判断和分类4-5。1.2.3 病原菌分子生物学鉴定使用浙江易思德生物科技有限公司基因组DNA提取试剂盒进行病原菌DNA提取，提取的DNA于-20 保存。采用大多数真菌 ITS 基因引物进行 PCR 扩增。上游引物 ITS1 和下游引物 ITS4 的序列分别为：ITS1（-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-）和ITS4（-TCCTCCGCTTATTGATATGC-）。PCR的反应体系（20 L）为Mix 10 L、DNA模板1 L、Forward Primer（5 molL-1）1 L、Reverse Primer（5 molL-1）1 L、ddH2O 7 L。PCR扩增程序：98 预变性3 min；98 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸60 s，共35个循环；最后72 延伸5 min。对纯化后的PCR产物进行回收，送至浙江尚亚生物科技有限公司进行测序。后续在GenBank上进行同源性分析，并使用MEGA11进行系统发育树的构建6。1.2.4 病原菌致病性测定根据科赫氏法则，将分离菌培养于PDA培养基中，28 培养 48 h。然后挑取单菌落接种于 30 mLPDA培养液中，28、160 rmin-1振荡培养48 h，用无菌水配制成1108cfumL-1的孢子悬浮液。将菌悬液灌根于长势良好的盆栽中，然后正常管理培养，接种120 d后刨根进行发病调查。1.2.5 生防菌的分离与纯化分别在河北省承德市隆化县北苍术种植田、河北省承德市青龙县大王庙北苍术种植基地、河北省保定市蠡县半夏种植田、河北省保定市安国县药博园，采集510 cm深的根际土壤。采用稀释涂布平板法进行菌种的分离与纯化：称取 10 g 土样，装入盛有 90mL 无菌水的三角瓶中，摇床振荡 20 min，然后放入80 的恒温水浴锅中搅拌10 min，静置5 min，制成土壤菌悬液原液。对土壤菌悬液原液进行梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-44种稀释度的土壤菌悬液，分别吸取 100 L 土壤菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，将培养皿倒置于28 恒温箱中培养 34 d，挑取单菌落在新的NA平板上重新接种进而纯化35次。1.2.6 生防菌的筛选将供试病原菌接种于 PDA 固体培养基上，在28 恒温箱内培养24 h，用直径为8 mm的无菌打孔器在菌落上打出直径一致的菌饼，备用。将纯化好的生防菌株接种于NB培养液中，28、160 rmin-1振荡培养12 h后，将菌液均匀涂布于NA平板上，于 28 培养箱内培养 24 h，用直径为 8 mm的无菌打孔器在菌落上打出直径一致的菌饼，备用。2825农业环境科学学报第41卷第12期采用平板对峙法7，将病原菌菌饼摆放到PDA平板