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几种测定生物大分子分子量方法的比较 摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白质(多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂类等。因为分子量小于500的单体可以通过聚合作用形成的大分子。测定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白质、核酸、酶、多糖以及脂类等鉴定中的首要参数。当前医学，药学及生物科学学科之间交叉渗透为测定生物大分子分子量提供了更多的契机，本文对测定生物大分子分子量的方法：生物质谱法，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶渗透色谱法等技术的原理及优缺点进行综述。 关键字：生物大分子 分子量测定 蛋白质 多肽 21世纪是生命科学的世纪，随着人类基因组，水稻基因组等的测序基本完成，蛋白质和结构基因组研究也迅速发展。负责生命活动的是生物大分子，生物大分子之间的相互作用构成了生命活动的基础，因此，测定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的结构功能是掌握生命活动的关键。生物大分子是细胞的基本结构和功能单位,也是研究生命现象中的物质基础.生物体内的分子组成如何?哪些分子才算生物大分子?这些大分子有没有分子量的下限?怎么去测定生物大分子分子量？要想知道这些答案，需要多方位，运用多种方法进行研究。 1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量，常用的方法为SDS—PAGE不连续系统。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N，-亚甲基双丙烯酰胺经共聚合而成，此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的，被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使得多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 在一定条件下，蛋白质，多肽在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸在聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳中，其分子量与电泳迁移率符合的关系。在精确测定与计算相对迁移率时，要求分别测定样品区带中心及指标剂染料区带中心(通常插入铜丝作为标记)与凝胶顶端(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或点样孔(琼脂糖凝胶电泳)间的距离。SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 SDS -PAGE电泳法是实验室中应用最普遍的方法,分为还原电泳和非还原电泳,非还原电泳中二硫键未打开,还原电泳中二硫键被还原,蛋白质分子能充分伸展,两者相比,还原电泳的测定结果更为准确。 优缺点：实验成本较低，样品用量少，时间短，操作简单，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可，分辨率高。但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术。 2. 凝胶渗透色谱（GPC） GPC是一种用溶剂作流动相，多孔性填料或凝胶作为分离介质的柱色谱，主要根据溶液中分子体积( 或称分子的流体力学体积 )大小的不同作为分离基础，使被分离样品按分子量大小先后流出色谱柱。凝胶床由多孔溶胀凝胶组成，当样品通过色谱柱时，物质在柱中受到固定相的阻滞作用，分子量大的不能渗入凝胶颗粒，只能沿溶胀凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，流程短而先流出色谱柱；分子量小的将渗入凝胶颗粒，受到的阻滞作用大，移动流速慢，流程长而较后流出色谱。 优缺点：凝胶渗透色谱法分离速度快，分析时间短，重复性好，进样量少，自动化程度高，但设备投入大，价格较高。 3.质谱技术 3.1 MALDI—TOF质谱技术 对热敏感的化合物进行快速加热，可以避免其受热分解而转入气相，所以进行质谱法分析，采用MALDI—TOF法尤为适用，测定的化合物相对分子质量可达数十万。MALDI—T0F的应用范围广泛，包括有机小分子、有机高聚物和生物大分子。它在生物大分子领域的应用尤为引人注目。 基质辅助激光解吸附质谱技术是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据检测器的飞行时间不同，导致测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。MALDI产生的离子常用飞行时间(time—of—flight，TOF)检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI—TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子分子量进行测量测。 3.1.1测定多肽与蛋白质分析 生物工程产品中多肽与蛋白质是最主要的产品类型，对这些生物工程产品进行质量控制，已成为当前一个很重要的课题。MALDI—TOF已广泛用于多肽与蛋白质的准确测定及其纯度的评价。传统的测定，纯度及肽图的方法，应用凝胶电泳及高效液相色谱，这些方法不仅受多种实验条件(如色谱柱、流动相的选择等)所限，而且误差大，往往难以得到令人满意的结果，且操作十分复杂。 应用MALDI—TOF对生物工程产品进行准确的，纯度及质量肽图进行测定。对一级结构进行确证，得到了直观、准确(误差小于0.2％)的结果。这方面的报道不胜枚举，牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰岛素、肌 红蛋白、胰蛋白酶原等都已经成功测定，测定过程简便快速。 3.1.2测定多糖 近年来，人们对糖类化合物的生理功能有了新的认识，糖类化合物继蛋白质、核酸之后，成为生命科学领域中的又一研究热点。糖的性质与其大小密切相关，因此糖特别是多糖分布的测定，在糖类化合物的研究和应用中有着重要的意义。传统的多糖测定方法，如渗透法、黏度法、光散射法、凝胶色谱法等，不仅耗样多、误差大或受分子形状的影响，且各方法所测的性质不同，需要几种方法配合使用很不方便。而糖本身高极性、难挥发的性质以及多糖较高的和其的发散，使糖类物质的质谱表征比较困难。但MALDI—TOF在这一领域显示出一定潜力和应用前景。 在测定多糖时，往往得不到高质量区，主要是聚合度低的分子优先电离的趋势抑制高，的多糖离子化过程。用凝胶柱处理过的多糖，分布范围变小，得到MALDI谱图效果变好。多糖的正、负离子基质辅助激光解吸电离质谱(MAIDI．MS)图谱已无明显差别。这意味着寡糖、多糖的离子化过程可能不同于寡糖在激光解吸／电离过程，离子的形成主要是中性分子热蒸发并随后形成阳离子化的过程。随着的增加，这种热力学解吸过程越来越困难。对高多糖来说，电离主要是依靠激光解吸／电离的集合作用完成的，大量基质分子共振吸收激光能量后，通过集合作用使基质和供试品的固体溶液发生解聚，产生带有随机电荷量的分子簇和团粒，并在向真空蒸发过程中冷却，留下带电荷的大供试品离子。这种情况下，正、负离子生成几率差不多，使得多糖的正、负离子MAlJDT—TOF谱比较接近。综上所述，糖类化合物辅助激光解吸／电离的离子化过程与其大小 有关。低时，热力学过程占主导地位；高时，非热力学过程占主导地位，这两种过程的差异，导致了寡糖和多糖正负离子MALDI—TOF谱图的差异。此结论显示出MALDI—TOF对多糖的应用还需探索。 3.1.3测定核苷酸 核苷酸也是具有极其重要生理功能的大分子物质，极性大，热不稳定，与蛋白质类似，MALDI—TOF在对核苷酸的测定方面，显示巨大潜力。用酶解法与MALDI—TOF分析结合，可测定较多碱基的核苷酸的碱基序列。MALDI—TOF对固相合成法合成的大分子核苷酸进行了测定。准确表征了其合成的功效。 MALDl—TOF与传统的磁式质谱相比，其特点有①可实现纳秒量级的瞬时记录，经过多次瞬时记录累加得到的质谱图，其信噪比得到了极大的改善。②具有高的离子流通率，因而获得高的灵敏度，仅需约lpmol的供试品即可测定。③原则上没有范围限制。 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性，提供样品分子的相对分子质量和丰富的结构信息，可用于大规模高通量分离分析和检测。它以其高灵敏度、低供试 品消耗量、能确立分子式等优点，在现代仪器分析中发挥着 越来越重要的作用。 综上所述，MALDI—TOF作为一个新技术，它已经成为测定生物大分子的重要方法，尤其是蛋白组的研究中，可以鉴定细胞有哪些蛋白质组，是不可缺少的方法 3.2 电喷雾离子化质谱技术 电喷雾电离质谱技术(electrospray ionization mass spec— trometry，ESI—MS)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或 多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 电喷雾电离质谱的优势在于它能方便地与多种分离技术联合使用，如液—质联用(LC—MS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。 优缺点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费（2）对样品分子质量测试的灵敏度，分辨力和准确度都相当高（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳，高效液相色谱等，是解决非挥发性，热不稳定性，极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。 3.3 FT Orbitrap（傅立叶变换静电场轨道阱） 在1999年的ASMS上，质谱学家Alexander Makarov 报告用一种新的质量分析器静电场轨道阱进行高分辨和精确质量数测量。第一台Orbitrap质谱仪诞生于2001年，在爱丁堡大学的实验室使用。Orbitrap 是近20多年来质量分析器的突破性技术。这是一种采用新结构 质量分析器和突破性技术的质谱仪器，离子在质量分析器里作轨道旋转和振荡，Orbitrap 质谱仪的检测方式是通过离子的旋转振荡产生的镜像电流，经微分放大后由FT变换器转换为各离子的振荡频率，最后计算出分子离子的质核比(m/z)。这种通过频率来测量质核比的方式，可以得到超高的分辨率，Orbitrap的质量分辨率介于FTICR（傅立叶变换离子回旋共振质谱）和TOF（飞行时间质谱)之间,最高分辨率可达到10万。 Orbitrap的工作原理：质量分析器形状如同仿棰体，由仿棰形中心内电极和左右2个外仿棰半电极组成。Orbitrap对离子的操作步骤分为离子捕获、旋转运动、轴向振动和镜像电流检测。仪器工作时，在中心电极逐渐加上直流高压，在Orbitrap内产生特殊几何结构的静电场。当离子进入到Orbitrap室内后，受到中心电场的引力，即开始围绕中心电极作圆周轨道运动，m/z 高的离子有较大的轨道半径。同时离子受到垂直方向的离心力和水平方向的推力，而沿中心内电极作水平和垂直方向的震荡。外电极除限制离子的运行轨道范围，同时检测由离子振荡产生的感应电势，其中水平震荡的频率和分子离子的质荷比(m/z)的关系可由以下数学公式来描述，可见轴向频率与离子的初始状态是无关的,这种不相关性造就 Orbitrap 具有高分辨率和高质量准确度的特性。从 Orbitrap 的每个外电极输出的时域信号经过微分放大器放大后由快速傅立叶转换变成频域谱，频域谱再进而转换为质谱，然后在 Xcalibur 质谱软件中处理输出。 质谱方法是蛋白质组学研究的关键