阿魏酸钠经RhoA和Rho...抑制小鼠肝纤维化的机制研究_赵蔚林.pdf

医学理论与实践2023年第36卷第3期Vol.36，No.3，Feb2023J Med Theor Prac阿魏酸钠经 hoA 和 ho-kinase 信号通路抑制小鼠肝纤维化的机制研究*基金项目:湘潭市科技局 2021 年科技研究项目(CG ZDJH202135)赵蔚林李君湘潭医卫职业技术学院，湖南省湘潭市411102摘要目的:探讨阿魏酸钠对于四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的抑制机制。方法:将 CL 级昆明属小鼠随机分为正常对照组、CCl4-花生油模型组(模型组)、阿魏酸钠给药组(给药组)，每组 20 只。模型组小鼠和给药组小鼠分别给予CCl4-花生油(1 1，V/V)1ml/kg 灌胃，正常对照组小鼠给予同等剂量生理盐水，三组均为 1 次/d，连续 8 周;从第 9 周开始，给药组小鼠给予阿魏酸钠 20mg/kg 灌胃，1 次/d，连续给药 4 周。12 周后，检测各组小鼠肝功能水平、肝影像学指标、病理变化及肝脏中 hoA、ho-kinase 的总体情况。结果:通过正常对照组、模型组及给药组的小鼠肝功能和肝纤维化指标等指标对比，发现阿魏酸钠能显著抑制小鼠肝纤维化程度。结论:阿魏酸钠可能通过调节 hoA 和 ho-kinase 信号通路抑制小鼠肝纤维化。关键词阿魏酸钠肝纤维化hoA 和 ho-kinase 信号通路中图分类号:-33文献标识码:Adoi:10.19381/j.issn.1001-7585.2023.03.001Mechanism of Sodium Ferulate Inhibiting Liver Fibrosis in Mice Via hoA and ho-kinase Signaling PathwayZHAO Weilin，LI Jun Xiangtan Medicine and Health Vocational College，Xiangtan City，Hu nan Province411102ABSTACT Objective:To investigate the inhibitory mechanism of sodium ferulate on carbon tetrachloride induced liver fibro-sis in mice Methods:Male CL mice were randomly divided into three groups:normal control group，CCl4peanut oil modelgroup(model group)and sodium ferulate administration group(administration group)，with 20 each In addition to the normalcontrol group，the remaining mice were injected with 1ml/kg of CCl4peanut oil(1 1，V/V)by gavage to establish the mouseliver fibrosis model once a day for 8 weeks At the same time，mice in the normal control group were injected into the abdomi-nal cavity with the same dose of normal saline for 8 weeks After 8 weeks，the mice in the administration group were injectedwith sodium ferulate into the abdominal cavity once a day for 4 weeks at a dose of 20mg/kg The mice were weighed(fasting)，anesthetized and sampled with pentobarbital sodium，and the main clinical diagnostic indexes of liver fibrosis:liver functionlevel，liver imaging indexes，pathological detection and liver fibrosis indexes，as well as the overall situation of hoA andho-kinase in the liver of mice in each group esults:Comparing the indexes of liver function and liver fibrosis in normal con-trol group，model group and administration group，it was found that sodium ferulate could significantly inhibit the degree of liv-er fibrosis in mice Conclusion:Sodium ferulate can inhibit liver fibrosis by regulating hoA and ho-kinase signaling path-waysKEY WODSSodium ferulateHepatic fibrosishoA and ho-kinase signaling pathways肝纤维化(Hepatic fibrosis)是肝脏受到损伤后，产生的一种持续存在状态。其是肝脏组织开始修复时，如果细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的合成与降解平衡状态发生失衡，从而导致肝脏出现的一系列病理学改变1-2。当机体发生肝纤维化时，如不及早进行干预治疗，将发展为肝硬化，甚至肝癌。现阶段肝硬化、肝癌是我们国家常见病、多发病及重要的死亡原因，其病理主要特征为肝组织呈现弥漫性纤维化、假小叶及再生结节形成3。据目前研究发现肝纤维化的典型特征为肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)活 化 和 ECM 沉积4，分子机制涉及到炎症因子、生长因子、趋化因子和氧化应激相关分子等，因此，深入研究肝脏纤维化的发病机制，并由此基础上探索新的治疗靶点，在减少肝硬化和肝癌的发生尤为重要。阿魏酸钠(化学名称:3-甲氧基-4-羟基桂皮酸钠盐二水合物)系阿魏、川芎、当归等中药提取物中的单体活性成分经化学修饰所得。现代药理学研究表明，其具有抗氧化、抗凝、抗炎、改善血液流变学等功效，现临床上广泛运用于心血管系统疾病的治疗5。但据最新研究报道，发现阿魏酸钠具有抑制肝纤维化的功效，但具体作用机制现阶段尚不明确6。本研究将以信号通道为切入点，构建以 CCl4-花生油诱导肝纤维化模型，通过阿魏酸钠治疗的肝163J Med Theor PracVol.36，No.3，Feb20232023年第36卷第3期医学理论与实践纤维化小鼠为研究对象，探讨阿魏酸钠抑制肝纤维化的分子作用机制，从而为临床治疗肝纤维化提供一种新的途径。1材料与方法1 1材料(1)动物:雄性 CL 小鼠 60 只，体质量160 210g(中南大学湘雅医学院)，实验动物编号:SYXK(湘)2015-0014。饲养条件:温度 25，湿度(55 10)%，给予标准的食物和水。(2)主要试剂及仪器:阿魏酸钠(成都嘉叶生物科技有限公司，纯度:98%)。CCl4购于江苏清泉化学股份有限公司(批号 20210901);花生油购于青岛吴昊植物油有限公司。透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、型前胶原肽(PP)和型胶原(C)试剂盒，BCA 蛋白浓度测定、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂试剂盒均购自上海透景生命科技股份有限公司;兔多克隆hoA 抗体、小鼠单克隆-SMA 抗体购于湖南纯清生物科技有限公司。兔多克隆 eNOS 抗体、OCK抗体购自广东椰泰生物科技有限公司。DAB 试剂盒购于山东滨州智源生物科技有限公司。1 2实验方法1 2 1小鼠肝纤维化模型建立:适应性饲养 1 周后，将小鼠依据随机数字表法分成正常对照组、模型组、给药组，每组 20 只。模型组和对照组小鼠均灌胃给予 CCl4-花生油(1 1，V/V)1ml/kg 灌胃，1 次/d，连续 8 周。从第 9 周开始，给药组各小鼠给予阿魏酸钠 20mg/kg 灌胃，1 次/d，连续给药 4 周。1 2 2小鼠肝脏标本制作:12 周后，将小鼠分别称重，并按照 50mg/kg 剂量戊巴比妥钠，分别进行麻醉，于腹主动脉处取血，并分离，留取血清;同时制作各组肝脏组织标本，逐个称肝重并记录，然后用剪刀在各小鼠的肝脏相同部位剪取组织标本，置于福尔马林溶液中固定，剩余肝组织迅速置于 80 冰箱中冰冻并留存7。1 2 3肝组织影像学检测:对实验小鼠最后一次给予阿魏酸钠灌胃后，当即随机从各组中抽取 5 只小鼠，分别对其进行肝脏超声检测。对被检测小鼠，予以禁食、不禁水 8h，并按照体重，腹腔内分别注射戊巴比妥钠(给药剂量:50mg/kg)，以麻醉小鼠，完善小鼠肝区体毛剃除，充分暴露肝脏体表投影区域，将其仰卧位固定于试验平板，采用飞利浦 Affiniti 70 彩色多普勒超声诊断仪，并采用其配备弹性成像定量软件包及 eL18-4 铂净线阵探头(频率:4 18MHz)。扫描小鼠肝脏，检测肝脏大小、形态、软硬度等指标，得到二维均值。1 2 4肝功能及肝纤维化指标检测:采集各组试验小鼠血清，运用全自动生化仪，对血清中天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransfease，ALT)的表达情况进行检测8。运用全自动化学发光免疫检测仪，分别对小鼠血清标本中肝纤维化指标:透明质酸(HA)、型胶原(C)、型前胶原肽(PP)和层黏蛋白(LN)的含量进行检测，并分别记录3。1 2 5肝脏组织病理学检测:分别对各试验组小鼠的肝脏组织，采用 4%多聚甲醛溶液进行固定 48h以上，并常规使用石蜡包埋，制作成 5m 厚度的组织切片，对其分别予以 HE 和 Masson 三色染色，在光学显微镜下观察各试验组小鼠肝脏组织的病理染色情况3。并严格按照 2000 年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会一起联合制定的病毒性肝炎防治方案 中，对肝脏组织结构破坏类型、范围及程度，将对肝微循环影响的大小将肝纤维化划分为 1 4 期(S1 4)9，见表 1。对各小鼠肝组织切片，在显微镜下拍照，并按照分组及病理变化分类。表 1肝纤维化分期分期病理改变S1包括汇管区、汇管区周围纤维化和窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕，二者均不影响小叶结构的完整性S2桥接纤维化，虽有纤维间隔形成，但小叶结构大部分仍保留S3大量纤维间隔，分隔并破坏肝小叶，致小叶结构紊乱，但尚无肝硬化S4早期肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成1 2 6肝组织免疫组化检测:将各组小鼠肝组织切片置放玻片上，使用二甲苯、中 10min 浸泡，使其充分脱蜡;各组织乙醇浸泡 6min，然后流水 15min浸洗，再将载玻片置于 PBS 玻片缸，摇床上晃动并洗涤 6min 3 次;在室温、严格避光的环境下，予3%H2O2以 20min 孵育，再 PBS 洗涤 6min 3 次;滴加入 5%BSA 溶 液，并 采 用 室 温 条 件 下 封 闭30min，倾除多余溶液。1 2 6 1肝脏组织中 hoA 呈现情况:对兔来源抗hoA，使用 PBS 对其 1 300 比例进行充分稀释，滴50 100l 至切片，在 10冰箱中孵育 12h;取出后室温下静置 2h，PBS 反复洗涤 10min 4 次，再切片放至苏木素染液中，染色 15s 后