‘龙眼’葡萄酒微生物变化及与挥发性香气的相关性分析_罗飞.pdf

12023.1研究报告中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINE龙眼葡萄酒微生物变化及与挥发性香气的相关性分析罗飞1，师旭2，王颉3，庞永宏4，赵彦敏5（1.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北秦皇岛 066000；2.中粮长城桑干酒庄（怀来）有限公司，河北张家口 075400；3.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000；4.张家口市食品药品检验中心，河北张家口 075000；5.河北省张家口市农业广播电视学校，河北张家口 075000）摘 要：以龙眼葡萄为原料，通过高通量测序和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，对干白葡萄酒发酵过程中的微生物演替和挥发性香气变化进行了监测。得到相对含量1%的优势细菌20种、真菌6种；鉴定出挥发性香气28种。利用正交偏最小二乘（R20.5，Q20.5）和Spearman（|R|0.7）对优势微生物与挥发性香气化合物进行相关性分析。结果表明，龙眼干白葡萄酒发酵过程中VIP1的细菌11种，真菌2种；其中4种细菌和1种真菌与发酵过程中产生的挥发性香气呈显著正相关，特别是地芽孢杆菌属（Geobacillus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和嗜热厌氧杆菌属（Thermoanaerobacterium）与乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、4-萜烯醇、-大马士革酮、乙酸苯乙酯和癸酸异戊酯等呈极显著正相关。关键词：龙眼干白葡萄酒；微生物群落；挥发性香气；相关性 中图分类号：TS262.61；O657 文献标志码：ADOI：10.13414/ki.zwpp.2023.01.001收稿日期：2022-09-02基金项目：河北省科技计划项目（19227120D）作者简介：罗飞（1982），男，硕士，研究方向为葡萄酒酿造工艺。E-mail:Microbial Changes of Longan Wine and Correlation Analysis with Volatile AromaLUO Fei1,SHI Xu2,WANG Jie3,PANG Yonghong4,ZHAO Yanmin5（1.COFCO Huaxia Greatwall Wine Co.,Ltd.,Qinhuangdao 066000,China；2.COFCO Greatwall Chateau Sungod(Huailai)Co.,Ltd.,Zhangjiakou 075400,China;3.College of Food Science and Technology,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China；4.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center,Zhangjiakou 075000,China;5.Zhangjiakou Agricultural Radio and TV School in Hebei,Zhangjiakou 075000,China)2023(1):1-7Abstracts:In this study,Longyan grape was used as test material,and the dynamics of microbial community and volatile compounds during dry white wine fermentation were monitored by high-throughput sequencing and headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry.Twenty species of bacteria and six species of fungi with relative content 1%were obtained.Twenty-eight volatile compounds were identified.The orthogonal partial least squares（R20.5,Q20.5）and Spearman(|R|0.7)were used to analyze the correlation between dominant microorganisms and volatile compounds.The results showed that there were eleven species of bacteria and two species of fungi with VIP1 during fermentation of Longyan wine dry white,among which four kinds of bacteria and one kind of fungi had a significant positive correlation with volatile aroma,especially Geobacillus,Lactobacillus,and Thermoanaerobacterium were significant positive correlation with decyl acetate,phenethyl acetate;4-terpineol,-damascenone,phenethyl acetate and isoamyl decanoate.Key words:Longyan dry white wine;microbial community;volatile aroma;correlation2研究报告2023.1中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINE龙眼葡萄是中国最具特色和代表性的鲜食酿酒兼用品种，有近千年的栽培历史，目前主要在怀来地区有集中种植，且面积逐年缩减。据怀来县统计局数据，2021年龙眼葡萄种植面积约有20 hm2，有两家企业酿造龙眼干白葡萄酒，其他均以鲜食消费。因此龙眼葡萄面临被淘汰的风险。众所周知，葡萄酒复杂的风味很大部分是一系列微生物代谢活动的结果1，微生物对葡萄酒香气的贡献，及其在葡萄酒品质中的改良始终在研究之中2-3，大量芳香化合物在酿酒酵母初级发酵过程中形成4。此外，现有研究表明，接种本土非酿酒酵母可以改善葡萄酒的芳香特征5，如有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和高渗汉森酵母（Hanseniaspora osmophila）可以分泌多种水解酶，有助于葡萄酒花香物质的产生6；而葡萄酒微生态系统除以酿酒酵母、非酿酒酵母为代表的真菌群落外，细菌群落也对葡萄酒风味存在重要影响，其中乳酸菌（LAB）具有广泛的酯合成和水解活性。许多研究中观察到苹乳酸发酵（MLF）后，乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乳酸乙酯水平增加7-8，其中最常用的酒酒球菌（Oenococcus oeni）的多糖被证明具有与释放的香气化合物结合的能力，从而影响最终的葡萄酒香气9。近年来国内外通过高通量测序（HTS）技术报道了不同产区、不同葡萄品种发酵过程中微生物多样性组成和其此消彼长的变化及其与挥发香香气的相关性10，如威代尔冰白葡萄酒11、法兰娜（Falanghina）甜葡萄酒12和马瑟兰13红葡萄酒已有报道，然而我国独有的龙眼干白葡萄酒工业发酵过程尚缺乏相关研究。本研究对龙眼干白葡萄酒发酵过程中微生物群落变化及其与挥发性香气变化相关性分析，将为我国本土品种龙眼干白发酵过程中微生物多样性研究提供一定理论支持，从而了解葡萄酒风味特征的形成和质量控制，为酿酒师监控发酵过程提供依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 葡萄原料龙眼葡萄产自怀来，行距2 m，株距0.8 m。1.1.2 酵母选择酿酒酵母（S.cerevisiae）VL2，由Lamothe Abiet 公司生产，经酿酒师长期验证，具有低温耐受性强、启动发酵快的特点，适合龙眼干白葡萄酒的酿造。1.1.3 主要试剂 果胶酶（食品级），Laffort公司；氯化钠（分析纯）、偏亚硫酸钾（食品级），国药集团有限公司；甲醇（色谱纯），北京迪科马科技有限公司；3-辛醇（分析纯），美国Sigma公司；FastDNA Spin Kit for Soil DNA抽提试剂盒，美国MP Biomedicals公司；MiSeq Reagent Kit v3测序试剂盒，美国Illumina公司。1.2 仪器与设备 7890B-5977A气相色谱质谱联用仪，Agilent公司；57328-u顶空固相微萃取纤维头，Supelco公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m250 m0.25 m），Agilent公司；Autosampler 2707高效液相色谱仪，Waters公司；Wine Scan FT 120 FOSS仪，FOSS公司；2720 thermal cycler PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Illumina Miseq测序仪，美国Illumina公司。1.3 试验设计方法试验用10 t不锈钢控温发酵罐发酵，每罐9 t葡萄汁，设置3个平行处理。发酵工艺流程：葡萄原料穗选破碎除梗葡萄汁压榨（果胶酶 15 gt-1）焦亚硫酸钾处理（60 mgL-1）冷浸渍48 h澄清汁接种酿酒酵母（200 gt-1）控制发酵温度1213 进行酒精发酵发酵结束分离、调硫下胶热稳定试验冷稳定处理过滤干白葡萄酒。葡萄汁压榨、前处理和澄清：葡萄采收后，用氮气保护气囊压榨机（2 th-1）压榨获得葡萄汁（总糖：178.93 gL-1，总酸：9.2 gL-1），压榨过程中添加焦亚硫酸钾（60 mgL-1）和果胶酶（15 gt-1）。压榨出的葡萄汁在78 下放置48 h后分离出澄清汁（C），取500 mL用于后续分析。酵母活化及扩培：取5400 g活性干酵母，在38 水浴条件下，加入10倍水（54 L，38）进行活化。活化后的活性干酵母利用葡萄澄清汁（10）进行扩培，从38 开始按照每次6 的梯度依次降温，每次32023.1研究报告中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINE降温后保持35 min，将温度降至1113 后，等量接种于1113 葡萄汁中，48 h后，温度控制在1213 发酵，每天保持早中晚测量温度。各处理每隔1 d取样，至酒精发酵结束。取样共8次，分别为第2天、第4天第16天，记为L2、L4、L6、L8、L10、L12、L14、L16。在3个发酵罐上中下部取样共500 mL，样品经4 离心（9900 rmin-1离心15 min），上清液用于理化指标和挥发性香气分析。样品收集后，保存于80。至发酵液残糖小于2 gL-1时，结束取样。1.4 微生物群落测定方法参考先前方法将发酵过程中样品进行总DNA提取和检测，对细菌16S rRNA基因的V3V4区和真菌ITS rRNA基因的ITS区目的基因进行PCR扩增，3个平行样本PCR产物混合，用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测；按AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒说明对回收产物提取纯化，用微型荧光计进行检测定量。采用边合成边测序的方法在Illumina公司Miseq PE300平台上机进行高通量测序。1.5 理化指标测定方法总糖、总酸和酒精度：利用FOSS仪在Wine Scan FT 120从波数9265012 cm-1进行透射扫描测定；pH采用pH计法测定；甲醇参照GB/T 15038201614利用高效气相色谱仪测定。1.6 挥发性香气测定方法GC条件：Agilent HP-INNOWax毛细管极性色谱柱（60 m250 m0.25 m），进样口温度设定为240，载气为高纯He（99.999%），流速为 1 mLmin-1，不分流模式；柱箱升温程序如表1所示。MS条件：EI离子源，电子能量为70 eV，离子源温度2