2023年饲用酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究.doc

酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究 一、 概述 本项目2023年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。 酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活效劳，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。1897年Büchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和别离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质〔辅酶〕的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反响。1926年Sumner第一次从刀豆中别离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop又连续别离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2023多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速开展。20世纪40年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速开展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能降耗、保护环境重要意义；因此，这一产业的开展受到各国政府的高度重视，有着广阔的开展前景。 国际酶制剂市场目前保持着9％的增长速度，2023年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛开展，产量由1965年的10吨增长到2023年的219万吨，平均每年以20％以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与兴旺国家相比，存在的差距主要有：〔1〕技术研究与开发滞后，根底理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。〔2〕行业规模小而分散，市场调控能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世界酶制剂销售额5％，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的调控能力普遍较弱，企业间无序的价格竞争使整个行业经济效益下滑，使企业在技术创新、新品种开发、设备更新等方面力量缺乏，严重制约了酶制剂产业的可持续开展。〔3〕产品结构不合理，技术落后。我国酶制剂产品主要是以糖化酶、淀粉酶、蛋白酶为主，三者加起来占据全国酶制剂产量的97％，全国一半以上企业生产品种单一，抗市场风险非常弱。〔4〕酶制剂的应用开发力度不够，制约了酶制剂企业的市场开拓能力。 酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉〔Aspergillus niger〕、大孢子黑曲霉突变株〔A. niger var. macrosporus〕、斋藤曲霉〔A. saitoi〕、宇佐美曲霉〔A. usamii〕、泡盛酒曲霉〔A. awamori〕、微紫青霉〔Pen. janthinellum〕、常规青霉〔Pen. frequentens〕、杜邦青霉〔Pen. dupoti〕、宛氏拟青霉〔Paecilomyces varioti〕、小孢米曲霉突变株〔A. oryzacvar. microsporus〕、根霉〔Rhizopus sp.〕、微小毛霉〔M. pusillus〕、粘红酵母〔Rhdotorula glutinis〕、粟疫霉〔Endothia parasitica〕、血红色陀螺孔菌〔Trametes sanguinca〕、芽枝霉〔Cladosporium sp.〕等。1903年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2023年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。 微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3．350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3．350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等〔1994年〕用60Coγ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等〔1995年〕以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50℃，90℃下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等〔1999年〕，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等〔2023年〕对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等〔2023〕采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法别离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云〔2023年〕通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。 国内生产酸性蛋白酶的厂家，根本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流〔沸腾〕枯燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，参加絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，参加防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。  二、酸性蛋白酶制剂的作用机理和酶学特性 1、酸性蛋白酶的作用机理 酸性蛋白酶是一种天冬氨基蛋白酶，分子质量为30~40KD, 在其活性中心有两个天冬氨基残基，其代表性特征是能够在酸性或中性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。微生物酸性蛋白酶对肽键两端的苯环和大的氨基酸基团有较高的专一性，酸性蛋白酶的催化机理是酸碱催化作用，由活性位点的两个天冬氨酸在酸性或碱性条件下交替发挥作用，其中一个天冬氨酸失去质子，另一个天冬氨酸那么被质子化。 由于饲用酶进行催化反响在畜禽消化道内进行，故其作用条件必须与动物消化道生理条件相适应，而通常猪和家禽消化道内温度为40℃ 左右，而胃pH1.5—3.5，小肠pH5—7，与酸性蛋白酶作用的一些根本参数相吻合。畜禽尤其是幼龄动物的消化道内蛋白酶分泌体系发育不健全而在生长的中后期，自身虽有内源酶，但尚显缺乏，当采用高蛋白饲料饲养时，因其对饲料蛋白质消化能力较差而易引起腹泻等疾病。尤其是断奶仔猪，消化道发育不成熟，消化酶分泌系统不健全，特别是胃酸分泌缺乏，免疫功能低下，加上断奶时的生理、营养和环境应激反响，对饲料的营养成分不易消化和吸收，对病原微生物的抵抗力较弱，易造成正常肠道菌群平衡紊乱，经常出现较高的腹泻率，导致早期生长受阻。假设在饲料中添加酸性蛋白酶，那么能补充内源酶的缺乏，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽、胨及各种氨基酸，而易被畜禽消化吸收，从而降低饲料对断奶仔猪消化道的刺激，降低应激反响，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进生长。 2、酸性蛋白酶的酶学特性 酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物，不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质，但在底物pH值、特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。 (1)pH对酶活及酶稳定性的影响 酸性蛋白酶在pH2.0～6.0之间较为稳定，但不同的微生物所产酶的最适作用有所不同。曲霉属酸性蛋白酶最适作用pH值为2．5～4．0，稳定pH值为1.5～6.0。斋藤曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.0。米曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为3．0～4．0，稳定pH值为3.0～6.0。宇佐美曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2.5，稳定pH值为2.0～3.5。青霉属所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.5。酸性蛋白酶对pH值的要求，与酶活性中心的羧基有关。 〔2〕温度对酶活性及稳定性影响 酸性蛋白酶一般在50℃以下较为稳定，但也随产酶微生物的不同而有所差异。如根霉属所产酸性蛋白酶在30℃下只能保持30分钟，而曲霉属的斋藤曲霉所产酸性蛋白酶在50℃稳定，55℃处理10分钟才会失活。黑曲霉Vs、V315 菌株所产酸性蛋白酶在80℃保温2小时 后仍有90%的酶活力存在。青酶属产的门冬氨酸蛋白酶，最适pH值条件下，50℃时到达最大酶活。酵母菌所产酸性蛋白酶经60℃处理后还剩少许酶活力，经70℃处理后酶活完全丧失。 〔3〕金属离子对酶活力的影响 Ag＋ 对酸性蛋白酶有轻度抑制作用，当其浓度为5mol/L时，酶活下降15% ;Cu2＋、Mn2＋对其有激活作用，当Cu2＋的浓度为0.02mol/L时，对酶有明显的激活作用；Cu2＋、Mn2＋ 和Al3＋同时添加时，对酶有协同作用，使酶活提高1倍；Ca2＋本身并不抑制酸性蛋白酶的活性，但它可作为其它物质的辅助因子而对某些酸性蛋白酶产生抑制作用。液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。 〔4〕抑制剂对酶活力的影响 通常酸性蛋白酶的活性中心肽段是根本相似的，抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌来源的酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制剂—对-溴苯的抑制，但却对N-