2023年雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织ＮＯ生成的实验研究 雷公藤多苷片.docx

雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织ＮＯ生成的实验研究 雷公藤多苷片 　　 目的：探讨雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠病变关节组织iNOS表达和NO含量的影响。方法：在建立大鼠佐剂性关节炎模型根底上，给予不同剂量雷公藤内酯醇后，检测关节肿胀度和病变关节组织NO含量，观察病变关节组织病理损害程度和iNOS免疫组织染色结果。结果：与模型组比拟，3个雷公藤内酯醇治疗组关节肿胀度和病变关节组织NO含量明显减少，病变关节组织的病理损害明显改善，iNOS免疫阳性细胞积分光密度显著减少。结论：雷公藤内酯醇可抑制佐剂性关节炎大鼠病变关节组织iNOS表达从而减少病变关节组织NO含量。 　　关键词 雷公藤内酯醇 佐剂性关节炎 一氧化氮 一氧化氮合酶 实验研究 　　一氧化氮(NO)是重要的细胞因子，研究说明，NO参与了炎症反响和免疫损伤过程，在炎症过程中，单核细胞、巨噬细胞产生NO，加重炎症反响程度。有实验证据说明[1]，NO在类风湿性关节炎的发生开展中起重要作用，抑制和减少炎细胞产生NO，可明显减轻炎症病变程度。体外实验说明[2]雷公藤醋酸乙酯提取物可抑制类风湿性关节炎病人关节软骨细胞产生高浓度NO的病理损害程度。 　　而作为雷公藤的主要有效成分之一的雷公藤内酯醇，其治疗类风湿性关节炎的机理之一是否与其在体内影响病变关节滑膜组织细胞NO的产生过程有关国内外尚未见文献报道。本研究旨在建立大鼠佐剂性关节炎模型根底上，通过应用不同剂量的雷公藤内酯醇，观察其对佐剂性关节炎病变组织细胞iNOS表达和NO水平变化的影响，探讨雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎有关的作用机理。 　　1 材料和方法 　　1．1 药品和试剂：雷公藤内酯醇(纯度为99．95％，批号：20220422)购于福建省医学科学研究所，溶于2％丙二醇，并用200目滤器过滤除菌后备用。福氏完全佐剂(FCA)购于上海华美生物工程。一氧化氮(NO)检测试剂盒购于南京聚力生物医学工程研究所。兔抗大鼠一氧化氮合酶(NOs)多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、即用型碱性磷酸酶〔SABC〕试剂盒均购于武汉博士德生物工程。RY-2000瑞医病理图文分析系统(东南大学瑞医科技产品)。 　　1．2 动物分组：SD大鼠50只，由浙江大学医学院实验动物中心提供，雌雄不限，体重200~250g，自由饮食，适应性喂养7d后随机分成5组：①空白对照组(A组)；②佐剂性关节炎模型组(B组)；③低剂量(0．1mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(C组)；④中剂量(0．2mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(D组)；⑤高剂量(0．4mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(E组)。每组10只。 　　1．3 佐剂性关节炎模型的建立：福氏完全佐剂(FCA)制备，将液体石蜡和羊毛脂(2∶1)共热至70℃高压灭菌后，按每毫升参加卡介苗10mg制成。佐剂性关节炎诱发：用微量注射器于右后足跖皮内注射FCA0．1ml，约14d左右可诱发成功佐剂性关节炎模型，正常对照组注射等量生理盐水。 　　1．4 实验过程和方法：各组动物处理：佐剂性关节炎诱发的第15d，A组及B组动物右后足关节上方组织内肌肉注射等容积的2％丙二醇溶液，每天1次，连续5d；C组、D组和E组动物给予雷公藤内酯醇治疗，剂量分别为0．1mg/kg、0．2mg／kg和0．4mg／kg，于病变关节上方肢体肌肉内注射，每天1次，连续5d，于实验的第21d所有大鼠行心脏穿刺取血后处死。提取实验关节组织，然后进行一氧化氮(NO)检测和一氧化氮合酶(iNOs)免疫组织化学染色观察。 　　1．5 观察指标：分述如下。 　　1．5．1 足跖肿胀度：用容积测定仪测定右后跖排水量，以致炎前后排水量(ml)差值代表右后跖的肿胀度。 　　1．5．2 组织学观察：实验结束处死动物后，提取各组动物右后踝关节组织标本，福尔马林液固定，脱钙，常规制片，H.E染色镜检。 　　1．5．3 一氧化氮(NO)检测：提取各组动物右后踝关节组织标本，用生理盐水制成10％(w／v)组织溶浆，5000转／别离心15min，取上清液按照试剂盒说明书操作检测关节组织NO水平。 　　1．5．4 一氧化氮合酶(iNOs)免疫组织化学染色观察：取实验关节组织石蜡包埋块切片，用SABC法免疫组化染色，主要步骤为：常规脱蜡至水，滴加3％H�2O�2，室温放置5min；滴加10％正常羊血清，室温放置10min，勿洗；滴加兔抗大鼠NOs多克隆抗体(1∶250)，4℃、24h；滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶200)37℃，1h；滴加SABC，37℃，1h；随后进行DAB-H�2O�2显色5~8min；阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。每步之间用0．1mol／L PBS(pH7．4)洗3次，每次5min。常规脱水、透明、封片。结果判断：显微镜下滑膜组织细胞胞浆呈棕色着色者为阳性细胞。免疫组化染色结果用RY-2000瑞医病理图文分析系统进行光密度测算。 　　1．6 统计学处理：所有数据以均数和标准差(x±s)表示，各组均数与显著性检验用SPSS11．0 for windows软件分析。 　　2 结果 　　2．1 雷公藤内酯醇对大鼠右后跖关节肿胀度影响：正常对照A组大鼠右后足跖的肿胀无明显变化，肿胀度接近于零。B组大鼠右后足跖肿胀度明显，经雷公藤内酯醇治疗后，C、D和E组3治疗组大鼠右后足跖肿胀度显著减轻，与B组比拟差异有显著性(P[3]。近年来，不仅从生物学及病理学等方面对NO进行较为广泛的研究，而且随着对NO认识的逐步加深，NO在类风湿性关节炎(RA)发病中的作用日益受到重视。大量研究证实，在RA发病过程中，NO作为一种重要炎症介质直接参与炎症反响和关节损伤过程。体内NO异常升高，可导致血管过度扩张、渗出增加；同时还可以促进PGE2、MMP-2、IL-1等炎症介质的释放，加重炎症反响[4]。高浓度的NO通过与超氧自由基反响生成超氧亚硝酸根离子(ONOO�-)产生细胞毒作用，使关节软骨细胞、骨间质细胞受损，并可损伤血管内皮细胞等致骨循环障碍。在类风湿性关节炎的病理状态下，NO主要产生于滑膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、多核白细胞及淋巴细胞。[5] 　　本研究结果显示，佐剂性关节炎模型组大鼠关节组织内NO含量较正常对照组明显升高，结果提示，NO参与佐剂性关节炎发生的病理性损伤过程，与有关文献报道的结果相符[3-4]。 　　本研究说明，佐剂性关节炎模型组大鼠关节组织NO含量明显升高，经雷公藤内酯醇治疗，3个治疗组(C、D、E组)关节组织NO含量较模型组明显下降〔P＜0．05,P＜0．01〕。结果提示雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠关节组织内NO生成有明显抑制作用。进一步研究结果说明，经雷公藤内酯醇治疗后，佐剂性关节炎大鼠关节肿胀度及组织病理损伤程度较模型组明显好转。研究结果提示雷公藤内酯醇减轻佐剂性关节组织炎症反响的机制可能与其抑制大鼠关节组织内NO产生的作用有关。这也可能是雷公藤在临床上治疗类风湿性关节炎的机制之一。 　　NO在体内是经NOS催化由L-精氨酸(L-argin-ine)氧化成L-瓜氨酸的过程中生成的，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是NO产生过程的关键酶，已证明NO及iNOS在RA的病理过程中起很重要的作用[6]。有研究说明[1]类风湿关节炎及骨关节炎患者血清及关节液中NO含量增高，用iNOS的抑制剂可治疗鼠佐剂性关节炎，具体表现为可减轻足肿胀度，并可使踝关节滑膜炎和软骨损伤等病理变化明显减轻。本研究关节组织iNOS免疫组化染色结果显示，模型组关节组织内iNOS免疫组化阳性细胞的光密度值较正常对照组明显增多，经雷公藤内酯醇治疗后，3个治疗组关节组织内iNOS免疫阳性细胞的光密度值明显减少。而光密度值代表免疫阳性细胞上iNOS蛋白表达量的多少。研究结果提示，雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎组织细胞iNOS的表达有抑制作用，通过减少iNOS生成，从而减少病变关节组织内NO的含量，发挥治疗佐剂性关节炎的作用。 　　NO是一种嗜脂性高反响性细胞毒自由基和免疫活性介质，必须在iNOS诱导下合成，在许多疾病中参与组织的损伤。静息或正常细胞iNOS的表达甚微，当有炎性细胞因子如肿瘤坏死因子〔TNF-α〕、白介素1β〔IL-1β〕等刺激时即迅速表达，促进NO的大量生成和释放[7]。RA组织中的NO主要由NOS合成，在关节炎组织内也存在IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子，在它们的刺激诱导下，RA关节滑膜组织的滑膜细胞中iNOS表达上调，从而持续合成NO，引发滑膜炎症反响[8]。我们以往的研究说明[9-10]，雷公藤内酯醇可减少佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α的含量，因此，我们推测，雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎病变组织NO产生的作用机制除了通过其抑制病变关节组织细胞iNOS的表达外，还可能与雷公藤内酯醇对炎性细胞因子TNF-α的抑制作用有关。 　　4 参考文献 　　［1］Farrel AJ，Blade DR，Ralmer RM，et al．Increased concentration of nitrite in synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic disease［J］.Ann Rheum Dis，1992，51：1219-1225． 　　［2］郭万首，马丽，陶学廉，等．雷公藤对类风湿性关节炎病人软骨细胞一氧化氮合成、一氧化氮合酶活性及其mRNA 　　表达的体外抑制作用［J］.中华医学杂志，2001，81(17)：10355-10357． 　　［3］Hauselmann HJ Stefanovil RM，Michel BA，etal Differences in nitrc oxide production by superficial and deep human articular chondrocytes：implication for proteoglycan turnover in inflammatory joint diseases ［J］.J Immunol，2000，160：1444-1448． 　　［4］王斌，陈敏珠.一氧化氮与炎症性关节疾病［J］.中华风湿病学杂志，1999，3(3)：129． 　　［5］高培国，武永刚，王坤正，等.类风湿性关节炎及骨关节炎血清和滑液中一氧化氮的测量［J］.中国骨伤，2002，13(5)：276． 　　［6］Takeshi H，Etsuko A，Tomoo Y，et al．1Nitric oxide production by superficial and deep articular chondrocytes［J］.ArthritisRheum，1997，40：261-266． 　　［7］姚航平，李敏伟，张立煌，等.滑膜成纤维细胞环氧化酶-2和诱导型一氧化氮合酶在类风湿性关节中的表达［J］.中华检验医学杂志，2002，25(6)：345-347． 　　［8］Dayer JM．The process of identifying and understanding cytokines：from basic studies to treating rheumatic diseases［J］.Best Pract Res ClinRheumato，2004，18(1)：31-45． 　　［9］韦登明，明建扩，饶广勋，等.雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠T淋巴细胞的趋化作用［J］.中国临床康复，2001，5(12)：96-97． 　　［10］韦登明，焦效兰，孟丹，等.雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠关节组织MCD-1表达变化的影响［J］.浙江中医杂志，2022，42〔4〕：238-240. 　　收稿日期 2022-05-25