2023年唾液乳杆菌L3生物合成纳米氧化锌的工艺研究.doc

唾液乳杆菌 L3 生物合成纳米氧化锌的工艺研究 ：为获得晶体粒径为纳米级别且对致病菌有明显抑菌效果的纳米氧化锌产品，对乳酸菌生物合成纳米氧化锌的工艺条件进行探索。从断奶7~10 d健康仔猪的粪便中筛选出一株对高浓度锌离子具有耐受性菌株，并以此菌株为模板，氯化锌溶液为原料，分别研究了作用温度、作用时间、发酵后菌液的pH值、氯化锌原液的添加量四个因素对最终产品氧化锌的粒径、转化率及其对致病菌抑菌效果的影响。研究结果说明，当 0.25M ZnCl2底物浓度、体系 pH值为 7.0，70℃水浴温度下作用 25min时得到的氧化锌晶体粒径在 70 nm 左右，晶体形状均匀，且对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的抑菌效果较好，其最小抑菌浓度分别为0.024 mg/mL、0.029 mg/mL、0.016 mg/mL。将纳米氧化锌替代普通锌源添加在动物饲养中能有效改善猪仔生长性能。 关键词：乳酸菌；生物合成；纳米氧化锌；粒径；转化率 Biosynthesis of ZnO Nanoparticles by Lactobacillus salivarius L3 Abstract: In order to obtain the inerratic crystal of ZnO nanoparticles, ZnO nanoparticles was biosynthesized by using Lactobacillus salivarius L3. Lactobacillus salivarius L3 strain was isolated from faeces of healthy weaning piglets weaned at 7~10 d age. Effect of temperature, action time, raw liquor of pH value and the concentration of zinc solution on the synthesis were investigated. The optimum synthesis factors were determined by orthogonal experiment as follows: 0.25 M ZnCl 2 , pH 7.0, water bath temperature 70 ℃ and reaction time 25 minute. Under the optimum synthesis conditions, the size of the zinc oxide crystal grain were nearby 70 nm. Meanwhile the crystal shape was uniform and had a strong antibacterial capability against E. coli, Salmonella and Staphylococcus aureus. The minimum inhibitory concentration was 0.024 mg/mL to E. coli, 0.029 mg/mL to Salmonella,and 0.016 mg/mL to Staphylococcus aureus. Using ZnO nanoparticles instead of normal ZnO into animal feed will effectively enhance the growth performance of weanling pigs. Key words: Lactobacillus salivarius; biosynthesis; ZnO nanoparticle; crystal grain size; conversion rate 纳米材料〔nanomateria1〕是指结构单元的尺寸在 1~100 nm、介于宏观物体和原子簇之间的粒子。纳米 氧化锌是又称为超微细氧化锌，由于颗粒尺寸处于纳 米级别，比外表积急剧增加，使得纳米氧化锌产生了 其本体块状材料所不具备的外表效应、小尺寸效应和 宏观量子隧道效应等，因而具有比本体块状材料更强 的生物活性。 目前，纳米氧化锌的工业化生产方法很多，如沉 淀法等，但这些传统方法多为高温高耗能，对环境破 坏大 [1] 。而最近几年来，生物方法制备纳米材料得到 了一定的开展，如 DNA 分子、蛋白质、微生物、动 物和植物体 [2] 等被用来制备纳米材料。Sangeetha, G 等 用芦荟提取物成功合成纳米氧化锌材料 [3] 。王娜等用 收稿日期：2013-04-14 作者简介：胡文锋〔1964-〕，男，博士，副教授，研究方向：应用微生物 蛋壳薄膜作为生物活性载体，设计了一种在有生物活 性材料参与的条件下室温原位合成硒化铅纳米团簇的 新方法。该方法利用蛋膜上特定周期性分布的大分子 与无机前驱体离子之间的螯合作用和电荷作用来控制 硒化铅微晶的形成、聚集和分布，成功地制备出了具 有规那么形状的硒化铅纳米团簇 [4] 。这些生物材料都是 由无机成分和特殊的有机基质〔蛋白质、脂类或多糖〕 组成的复合材料，有机基质主要控制无机化合物的形 态，即这些无机结构的成核和生长主要由蛋白质和其 他生物大分子控制。使用生物体吸附有毒重金属离子， 并在细胞内或外将其复原制成纳米材料，这些生物体 近来被认为是可能的环境友好型“纳米工厂〞。 纳米氧化锌不仅在光化学领域有很好的应用，在 食品以及动物饲料中也发挥很大作用 [5] 。目前猪场养 殖发现高锌能有效防止断奶猪仔的腹泻问题。将纳米现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023, Vol.29, No.9 2193 氧化锌替代普通锌源，添加在动物饲养中，其高生物 活性、对肠道致病菌的抗菌性 [6] 和吸收率可以有效地 减少腹泻，降低料肉比，而且剂量更少，对环境污染 小，为人类健康造福，是目前代替高锌最理想的饲料 添加剂 [7] ，在饲料行业的应用前景广阔。 1 材料与方法 1.1 原料 1.1.1 样品来源 1.1.1.1 断奶 7~10 d 仔猪粪便 样品取自广州温氏集团养殖基地断奶 7~10 d 仔 猪粪便，经过实地观察都是健康猪样。 1.1.1.2 指示菌 大肠杆菌 O78，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等由 华南农业大学食品学院微生物实验室提供。 1.1.2 主要仪器设备 SM510 型高压蒸汽灭菌锅，Yamato ； LRH-250A 型生化培养箱，广东医疗器械厂； SW-CJ-2FO 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公 司；GB204 型电子天平，瑞典 Meltter Toledo 公司； FEI-Tecnai 12 分析型透射电子显微镜，荷兰 FEI 公司； Vertex70 傅立叶变换红外光谱仪，德国 Bruker 公司； 恒温摇床培养箱，低速离心机，恒温水浴锅，pH 计， 磁力搅拌机。 1.2 方法 1.2.1 耐高锌乳酸菌的筛选 1.2.1.1 乳酸菌的富集 将采集的断奶 7~10 d 的猪仔粪便参加到灭菌含 玻璃珠的高锌液体MRS培养基中37 ℃恒温静置富集 培养 24~48 h。 1.2.1.2 乳酸菌的别离纯化与鉴定 将富集的菌液进行别离纯化得到多种乳酸菌疑似 菌株，并进行形态学和生理生化鉴定试验，同时通过 抑菌实验筛选出抑菌效果较好的某菌株进行进一步的 16 S rRNA 序列分析法鉴定。 1.2.2 纳米氧化锌的生物制备 1.2.2.1 纳米氧化锌生物制备工艺流程 耐锌的乳酸菌培养完成之后调节菌液的 pH 值， 在磁力搅拌器作用下边搅拌边缓慢参加氯化锌溶液， 一定温度下水浴孵化一定时间。水浴结束将混合液恒 温静置陈化一段时间，最后离心收集产物 [8~9] 。 1.2.2.2 纳米氧化锌生物制备工艺条件的优化 根据单因素试验结果，选取氯化锌底物浓度、孵 化的水浴温度、孵化时间以及孵化时溶液的 pH 值作 为试验因素，设计四因素三水平 L 9 (3 4 )正交试验。通 过透射电镜对每组试验得到的产物进行晶体粒径分 析，以粒径为指标，通过对结果的极差分析和方差分 析确定纳米氧化锌的乳酸菌生物合成优化工艺条件。 1.2.3 验证试验 根据正交试验最正确组合选择乳酸菌合成纳米氧化 锌的优化工艺条件，参照上述试验操作流程得到的产 物离心洗涤枯燥后进行透射电镜分析和红外光谱测试 以及产品致病菌抑菌效果的检测 [10] ，分别测定目标产 物纳米氧化锌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球 菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 [11] 。并选用普通氧 化锌作为对照试验。 1.2.4 纳米氧化锌含量测定 离心收集得到的沉淀中除了目标产物纳米氧化锌 外同时还含有少量氢氧化锌沉淀，而氢氧化锌在 125 ℃是能分解成氧化锌和水，利用煅烧前后质量差计算 产物中目标产物氧化锌的含量，并根据总锌离子添加 量计算出转化率。 1.2.5 纳米氧化锌晶体的透射电镜分析 采用支持膜法，以水作为分散剂将固体粉末产物 分散在水中，同时用工作电压为 300W 的超声波震荡 5 min，超声结束用滴管吸取一滴滴在支持膜上，晾干 后上镜观察。透射电子显微镜工作参数为点分辨率： 0.34 nm，加速电压 100 kV，放大倍率 50 倍~37 万倍。 1.2.6 纳米氧化锌晶体的傅里叶红外光谱分析 将生物合成得到的固体产物灰化去除菌体后与 KBr 按 1:100 的比例研磨混匀后进行压片，成片后放 入样品室扫描检测，仪器工作参数为波数范围： 4000~400 cm -1 ，分辨率：4 cm -1 ，扫描次数：32 次。 1.2.7 纳米氧化锌的抑菌试验 无菌试管参加近似 5×10 9 CFU 细菌〔致病菌〕细 胞、5 mLMH 肉汤液体培养基，添加不同浓度的纳米 氧化锌产品。同时取另一支不加菌的试管，其他添加 物一致作为对照组。在 37 ℃培养 24 h，管中细菌细胞 没有明显增长的浓度即为纳米氧化锌产品对该致病菌 的最小抑菌浓度 MIC。 2 结果与讨论 2.1 乳酸菌的筛选与别离鉴定 2.1.1 初步别离与镜检结果 经过反复别离纯化，结合镜检，初步别离出四株 疑似乳酸菌株，分别命名为 L1、L2、L3 和 L4。其镜 检图如图 1~图 4，表 1 为这四株菌株的形态学特征。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023, Vol.29, No.9 2194 图 1 L1菌株镜检图〔×1000〕 Fig.1 Microscopic image of the L1 strain (×1000) 图 2 L2菌株镜检图〔×1000〕 Fig.2 Microscopic image of the L2 strain (×1000) 图 3 L3菌株镜检图〔×1000〕 Fig.3 Microscopic image of the L3 strain (×1000) 图 4 L4菌株镜检图〔×1000〕 Fig.4 Microscopic image of the L4 strain (×1000) 表 1 待检菌株的形态学特征 Table 1 Morphological characteristics of the indeterminacy strains 编号 菌落形态 革兰氏染色 个体形态 L1 乳白色，圆形，边缘完整、光滑、直径