2023年材料.doc

材料 窗体顶端 准备材料与实验方法 1.1载体与菌株 〔1〕载体：pMD18-T载体购于TaKaRa公司。pcDNA3.1+载体购于Invitrogen公司。其中pcDNA3.1+的载体结构如以下图 〔2〕大肠杆菌菌株〔用于克隆〕：DH5α，购于TransGen公司。 〔3〕细胞系：采用人羊膜上皮细胞〔WISH细胞〕，来源于本试验室的冻存细胞。 1.2PCR新增产物的检测和回收 将5μL标准分子量的DNAMarkerDL2023作为参考，所以首先需取1.5%的琼脂糖凝胶用来检验并测试PCR扩增所产生的物质，其次将5 μL的生成物质全部参加凝胶孔内。随后需要将凝胶孔内物质进行电泳，需要的电流是200mA，电压是200V，结束后应将凝胶孔内的成像结果进行观察并进行拍摄记录。此次实验需要在室内常温下进行，该实验方法对各种浓度回收中的琼脂糖凝胶60bp-20kb的DNA片段都有一定的实用。 琼脂糖凝胶回收：参考Omerga胶回收试剂盒说明书 1.3构建表达载体和酶切回收 1.3.1pMD18-T载体连接与转化 将回收的PCR产物连入pMD18-T载体上，根据说明书进行操作 1.3.2质粒的提取 连接pMD18-T，其中质粒小量的提取可以参考Omega公司的质粒小提试剂盒 1.3.3重组表达质粒的构建 将载体，即pMD18-T和pcDNA3.1+，进行双酶切，其中很关键的是该载体需要含有质粒。 1.3.4提取去内毒素和表达质粒的重组 参考Omega公司的Endo-freePlasmidMini Kit II(D6950-01)的说明书进行。内毒素的提取和重组。 1.4细胞培养 〔1〕首先需将细胞进行复苏 〔2〕对细胞进行培养，培养的过程只需常规操作进行培养 〔3〕将培养后的细胞冻存即可 1.5细胞转染 此次实验在细胞培养之后需将细胞进行转染 转染操作参考：Life Technologies公司的LipofectamineTM3000和Invitrogen公司的RNAiMAX 1.6提取细胞总RNA 在提取细胞RNA的过程需参考Omega的RNA提取说明书。 1.7实时荧光定量分析 在提取RNA后，需要将其测定浓度，并将其进行电泳检测，目的是检测质量是否合格，合格状态应是提取后的RNA仅有两条带，分别是28S和18S，并且18S的亮度应是28S亮度的一半。随后进行反转录操作〔参考依据：ThermoScientific反转录试剂盒〕。 1.8WesternBlot实验步骤 〔1〕首先提取蛋白 〔2〕使用SDS-PAGE试剂进行电泳 〔3〕将其进行转模 〔4〕观察抗原抗体发生免疫反响 1.9ELISA 使用17β-EstradiolEIAkit试剂盒对收集的细胞上清进行ELISA分析 1.10免疫组化过程 1.10.1石蜡切片的免疫组化实验步骤 〔1〕将石蜡切片并脱蜡至水 〔2〕进行抗原修复 〔3〕切断内源性过氧化物酶 〔4〕使血清或BSA处于封闭 〔5〕参加一抗 〔6〕参加二抗 〔7〕DAB显色 〔8〕将细胞核复染 〔9〕将封片进行脱水处理 〔10〕使用显微镜进行镜检，随后对图像数据收集分析。 1.11 活体实验的实施方案 〔1〕首先将试验分为5组，包括：PFT-μ 组、LPS组、PFT-μ-LPS组以及DMSO对照组和PBS对照组 注意：由于DMSO和PB分别属于PFT-μ和LPS的溶剂，所以实验中需要采用两个对照组 〔2〕将雄性鼠和雌性鼠放入同一个笼子后，第二天将带有阴道栓的雌鼠妊娠天数记录为0，随后将其随机分为组，每组放入6只 当雌鼠妊娠15天时，分别将它们进行DMSO、PFT-μ、LPS和PBS的注射。在妊娠15天时，将PFT-μ-LPS组，首先注射PFT-μ，大约1h过后再对其注射LPS。两次的量分别为：DMSO:100 μL;PFT-μ:1mg/只，浓度为10mg/mL的PFT-μ 注射100 μL;LPS:50 μg/只，浓度为0.5mg/mL的LPS注射100 μL;PBS:100 μL。 将雌鼠腹腔内注射各试剂，并在6h内第一只胎儿鼠分娩时，需要收集各组的胎膜。 1.12统计学分析 本实验通过建立试验组和对照组进行探究，并使用SPSS16.0和SAS进行单因素的方差进行分析同时带有显著性检验，产生的结果均已均值±标准误表示。其中差异显著使用x表示，即p＜0.05，差异极显著使用xx表示，即p＜0.01 窗体底