2023年乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究.doc

乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 ：研究乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽，为进一步研究花生粕专用蛋白基料产品提供理论根底。本研究运用单因素和正交试验方法对固态发酵制备花生蛋白肽工艺条件进行优化，其最正确制备工艺条件为：营养盐溶液添加量２５ｍＬ，乳酸菌液添加量５ｍＬ，２５℃下发酵７２ｈ。此工艺下制备的花生蛋白肽的可溶性氮浓度到达７０．９２ｍｇ／ｍＬ，发酵液对１，１－二苯基苦基苯肼〔ＤＰＰＨ〕自由基去除率为９５．００％，羟自由基去除率为８６．２８％。花生蛋白肽的抗氧化活性结果显示，对超氧阴离子自由基的去除率是７４．１９％，对铁离子和铜离子螯合率分别为１７．７１％和９３．２８％，对脂质过氧化的抑制率为３６．０３％，铁复原力和钼复原力吸光值分别为１．１０３和０．９８３。 关键词：乳酸菌；固态发酵；花生蛋白肽；抗氧化活性 　　 花生为豆科一年生草本植物，含有 ２５％～ ３６％ 的蛋白质和 １０％～２３％ 的碳水化合物。花 生籽仁提取油脂后剩余的淡褐色或深褐色的小块 状或粉末状的副产物称为花生粕，每年产量达 ４０００ｋｔ ，是一种大宗蛋白质和多糖资源 ［ １ ］ 。由于 榨油过程中的热变性使得花生粕的营养价值下 降，通常用做家畜饲料或肥料，产品附加值低，资 源浪费严重 ［ ２ ］ 。花生粕中的蛋白质经水解后可得 到活性短肽，具有去除自由基、螯合金属离子、抑 制脂质过氧化等抗氧化作用，抑制 ＡＣＥ 〔血管紧 张素转换酶〕活性以及抑制 α－ 葡萄糖苷酶活性 和降血糖作用 ［ ３ ］ 。 目前，蛋白质水解产生蛋白肽产品通常有三 种方法 ［ ４ ］ ：酸水解法、蛋白酶水解法和微生物发酵 法。酸法水解蛋白，氨基酸受损严重，水解难控制 而较少应用；酶解法可大量生产含有生物活性肽 的粗酶解物，但用于水解反响的蛋白酶的种类少， 不能很好地降解蛋白，使制取的生物活性肽苦味 不能根本脱除，从而影响产品口感；微生物发酵法 〔液体发酵法和固体发酵法〕具有发酵周期短，降 低生物活性肽的生产本钱等优点，具有广阔的发 展前景。 相比于液态发酵法，固态发酵法的优势非常明 显。首先，用于固态发酵的菌种的种类更多、工艺 过程更为简化；其次，固态发酵法可以实现更大规 模生产，花生蛋白肽产量更大，制备花生蛋白肽的 生产本钱明显降低；第三，固态发酵过程中根本无 对环境造成污染的废物产生。微生物固态发酵过 程中能分泌多种蛋白酶将大分子蛋白水解为蛋白 肽，同时，蛋白酶还可以水解除去花生蛋白中的胰 蛋白酶抑制剂等抑制因子和凝集素等抗营养因子。 本研究利用乳酸菌为发酵菌种，采用固态发 酵技术，以发酵时间、发酵温度、菌液量和营养盐 溶液量为试验因素，可溶性氮浓度、 ＤＰＰＨ 自由基 去除率和羟自由基去除率为考察指标，通过单因 素和正交试验对乳酸菌发酵条件进行优化，以期 得到最优的发酵条件，同时研究了发酵产物的体 外抗氧化活性 ［ ５ ］ 。旨在为今后深入研究固态发酵 花生粕蛋白产品在花生抗氧化活性蛋白肽、高营 养生物饲料、食品酿造专用蛋白基料中的应用提 供理论根底。 １　 材料与方法 １．１　 材料与试剂 热榨花生粕：山东鲁花集团。乳酸 菌 〔 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ 〕为本实验室别离保藏的菌种。 １ ， １－ 二苯基苦基苯肼〔 ＤＰＰＨ 〕、 Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ 〔 Ｓｉｇｍａ 公司〕； ＭＲＳ 液体培养基〔 Ｓｉｇｍａ 公司〕；尿素、无 水葡萄糖均为分析纯试剂〔国药集团化学试剂有 限公司〕。 １．２　 培养基 ＭＲＳ 固体培养基为液体培养基中添加 １．５％ 琼脂粉；固态发酵培养基：热榨花生粕 〔粉碎过 ５０ 目筛〕 ２０ｇ ， １２１℃ 灭菌 ２０ｍｉｎ 。 １．３　 菌种生长曲线绘制方法 从菌落平板上挑一个单菌落加到 ５０ｍＬ 的 ＭＲＳ 液体培养基中，在 ３７℃ 、 １６０ｒ ／ ｍｉｎ 条件下培 养 ４８ｈ ，每隔 ３ｈ 在 ５６０ｎｍ 下测定吸光值。 １．４　 乳酸菌液体种子制备方法 将 ５０ｍＬ 的 ＭＲＳ 液体培养基参加 ２５０ｍＬ 三角瓶中，接入活化的菌种 １ 环， ３７℃ 、 １６０ｒ ／ ｍｉｎ 条件下培养，当菌种生长到对数期，即菌种数约为 １０ ８ 个 ／ ｍＬ 时，即可用于固态发酵试验中。 １．５　 乳酸菌固态发酵花生粕工艺 在固态发酵培养基中参加乳酸菌液体种子和 营养盐溶液，在一定温度下密闭发酵一定时间，发 酵结束后参加蒸馏水，离心，取上清液过滤并定容 至 １００ｍＬ ，待分析。 １．６ 乳酸菌固态发酵花生粕单因素及正交试验设计 选取四个关键因素：发酵时间〔 Ａ 〕、发酵温度 　３９ 期 　　　　　　 明强强，等：乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 　　 〔 Ｂ 〕、菌液量〔 Ｃ 〕和营养盐溶液量〔 Ｄ 〕来进行单因 素及 Ｌ ９ 〔 ３ ４ 〕正交试验，以发酵产物中的可溶性氮 浓度、 ＤＰＰＨ 自由基去除率和羟自由基去除率为 评价指标，确定最正确工艺参数。每组试验进行 ３ 次平行试验，取平均值作为试验结果。 单因素试验根本试验条件为：发酵时间 ７２ｈ ， 发酵温度 ４０℃ ，菌液量为 ４ｍＬ ，营养盐溶液量为 ２０ｍＬ 。各因素其他试验水平见表 １ 。 表 １　 单因素试验水平表 Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｌｅｖｅｌ　ｔａｂｌｅ 单因素 Ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ 发酵时间 〔 ｈ 〕 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ 发酵温度 〔 ℃ 〕 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 菌液量 〔 ｍＬ 〕 Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ 营养盐溶液量 〔 ｍＬ 〕 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ １　 ３６　 ２５　 １　 １０ ２　 ４８　 ３０　 ２　 １５ ３　 ６０　 ３５　 ３　 ２０ ４　 ７２　 ４０　 ４　 ２５ ５　 ８４　 ４５　 ５　 ３０ ６　 ９６　 ５０　 ６　 ３５ １．７　 测定方法 １．７．１　可溶性氮含量的测定　　 采用 Ｌｏｗｅｒｙ 法 ［ ６ ］ 取样品液 １．０ｍＬ 参加 ５．０ｍＬ 试剂 Ａ 〔将碳 酸钠与氢氧化钠等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶 液，硫酸铜与酒石酸钾钠等体积配制硫酸铜—酒 石酸钾钠溶液，将这两种试剂按 ５０∶１ 的比例配 合，即为试剂 Ａ 〕，混合均匀，于室温放置 １０ｍｉｎ 。 再参加 ０．５ｍＬ 的 Ｆｏｌｉｎ－ 酚试剂，立刻混合均匀， ３０℃ 水浴 保 温 ３０ｍｉｎ 。以 试 剂 空 白 液 调 零，在 ７５０ｎｍ 处比色，根据标准曲线回归方程计算发酵 液中可溶性氮含量。 １．７．２　 抗氧化活性的测定 　　ＤＰＰＨ 自由基清 除率、羟自由基去除率、超氧阴离子自由基去除 率、铁复原力、钼复原力、铁和铜离子螯合力、抑制 脂质体过氧化力都按照 Ｙｕ 等 ［ ７ ］ 方法测定。 ２　 结果与分析 ２．１　 菌种生长曲线的绘制 乳酸菌的生长曲线见图 １ ，生长停滞期为 ３～ ９ｈ ，指数期为 ９～１５ｈ ，稳定期为 １５～３９ｈ ，衰亡期 为 ３９ｈ 以后。因此，在乳酸菌固态发酵研究中取 处于指数期的 １５ｈ 菌龄的菌种用于发酵试验。 ２．２　 单因素试验结果 ２．２．１　发酵时间对发酵效果的影响　　 图 ２ 所 示，在发酵时间 ３６～９６ｈ 范围内，发酵液中可溶性 氮含量先升高后下降，在 ６０ｈ 出现最大值； ＤＰＰＨ 自由基去除率呈现略微减小趋势；羟自由基去除 率呈现先增加后减小趋势，但变化幅度不大。发 酵初期，乳酸菌处于生长期，发酵液中菌体数量和 所产蛋白酶含量都较少，使得蛋白水解产物较少， 那么可溶性氮含量少。随着发酵时间延长，发酵液 中积累了相当多数量的蛋白酶，蛋白质底物与酶 接触几率增加，水解产物增多，可溶性氮含量到达 最大值。发酵时间继续增加，一方面发酵体系中营 养物质已经消耗较多，乳酸菌生长繁殖与蛋白酶水 解反响都需要底物蛋白质，不利于乳酸菌生长繁 殖，另一方面乳酸菌生长到稳定期乃至衰亡期，菌 １０ 　　　　　　　　　　　　　　 花 　 生 　 学 　 报 　　　　　　　　　　　　　　　４２ 卷 　体数量和蛋白酶数量不再增加，导致可溶性氮含量 减少。综合评价发酵时间对这三种指标的影响，确 定 ６０～８４ｈ 作为正交试验发酵时间水平范围。 ２．２．２　 发酵温度对发酵效果的影响 　　 如图 ３ 所示，在 ２５～５０℃ 发酵温度范围内，发酵液中的 可溶性氮含量呈现先减小后增加趋势； ＤＰＰＨ 自 由基去除率逐渐减小，但变化不大；羟自由基去除 率先增加后减小。温度是影响乳酸菌生长的一个 重要因素，在 ２５～３５℃ 温度范围内，乳酸菌快速 生长繁殖，虽然产生大量的蛋白酶，但是乳酸菌生 长需要消耗蛋白质，与蛋白酶水解反响竞争底物 蛋白，使得水解反响速率降低，发酵液中可溶性氮 含量减少。在此温度范围内的发酵液中的蛋白肽 的活性较高，那么去除 ＤＰＰＨ 自由基和羟自由基的 效果较好。当温度继续升高时，乳酸菌的生长繁 殖减缓，使得所产生的蛋白酶有充足的底物蛋白 水解，发酵液中的可溶性氮含量增加。但是，发酵 体系中蛋白酶含量增加使得已经水解生成的蛋白 肽继续水解成更小分子的肽或游离氨基酸，致使 对自由基去除率下降。综合评价发酵温度对这三 种指标的影响，确定 ２５～３５℃ 作为正交试验发酵 温度水平范围。 ２．２．３　菌液量对发酵效果的影响　　 如图 ４ 所 示，菌液添加量在 １～６ｍＬ 范围时，发酵液中可溶 性氮含量先减小后增加再减小，在 ４ｍＬ 出现最大 值； ＤＰＰＨ 自由基去除率呈现减小、增大的趋势； 羟自由基去除率呈现逐渐增加的趋势。当花生粕 质量一定时，乳酸菌接种量 １ｍＬ ，花生粕中的蛋 　３１１ 期 　　　　　　 明强强，等：乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 　　 白质既能满足乳酸菌生长繁殖又能提供足够的底 物蛋白用于蛋白酶水解作用。当乳酸菌接种量在 ２～４ｍＬ 范围时，发酵体系中的乳酸菌增加，那么所 产生的蛋白酶含量也增加，水解反响速率加快，发 酵液中的可溶性氮含量逐渐增大直至到达最大 值。当乳酸菌接种量继续增加时，发酵体系中的 营养物质满足不了过多菌种的生长繁殖的需要， 使得乳酸菌生长受到抑制，产生蛋白酶量减少，发 酵液中的可溶性氮含量随之减少。综合评价菌液 量对这三种指标的影响，确定 ３～５ｍＬ 作为正交 表 ２　 正交试验设计与极差分析结果 Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒａｎｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ 序号 Ｎｕｍｂｅｒ Ａ 〔 ｈ 〕 Ｂ 〔 ℃ 〕 Ｃ 〔 ｍＬ 〕 Ｄ 〔 ｍＬ 〕 可溶性 氮浓度 Ｓｏｌｕｂｌｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 〔 ｍｇ ／ ｍＬ 〕 ＤＰＰＨ 自由基 去除率 ＤＰＰＨ　ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉ