2023年鸡新城疫免疫检测程序.docx

鸡新城疫免疫检测程序 　 教学实习内容 　鸡新城疫的免疫检测 　目的：系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。 　实验材料：新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、5%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、15ml离心管、试管、96孔V型板、离心机等 　1.1%鸡红细胞悬液的制备 〔1〕每组采取3ml左右健康鸡静脉血，迅速注入装有约0.3-0.4ml抗凝剂的离心管内，轻轻颠倒混匀； 〔2〕参加适量生理盐水，混匀，3000rpmx10min，吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层 〔3〕参加适量生理盐水，重悬红细胞，3000rpmx10min，吸弃上清液。如此，重复3次。 〔4〕量取红细胞沉淀的体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，待用。 　2.HA试验 　根据所用NDV液的凝集价，配制4单位病毒液。 　3.HI试验 〔1〕待测卵黄样品的制备：用镊子敲破鸡蛋小头，将蛋清倒去，留蛋黄在蛋壳内；吸取0.5ml生理盐水，放入小试管内；去掉局部蛋壳，用1ml注射器〔不带针头〕吸取蛋黄0.5ml，加到有生理盐水的试管内，混匀〔防止其很多泡〕待检。 〔2〕按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。 〔3〕判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。 　结果与分析 　对所测得的结果进行分析，确定该鸡群目前的免疫状态，并对生产提出合理建议或给出科学指导。 　分析并指出影响本实验结果的主要因素。 　二．传染病的分子生物学检测——PCR检测〔以PCV2为例〕 　1.DNA提取： 　将猪肝脏称重后，按照1:3〔WV〕的比例参加PBS，μL提取DNA。 　取冻融、离心后的组织悬液/血清300μL，参加300 μL细胞裂解缓冲液和5 μL的蛋白酶K(20 mg/mL)，混匀，置50 ℃消化2 h，每隔30 min，剧烈震荡一次；参加等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，参加等体积的酚：氯仿：异戊醇〔25:24:1〕混匀后，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；用酚：氯仿：异戊醇〔25:24: l〕重复抽提一次；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，参加2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠〔pH 5.2〕，室温放置30 min 以沉淀基因组DNA；4 ℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；用75%乙醇1 mL 洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 rpm 离心min后，上清，μL含RNaseA(20 μg/mL)的TE溶解DNA沉淀，直接用于检测病毒DNA或-20 ℃保存待测。 　2.PCR检测： 　将所提取的DNA用特异性引物进行PCR扩增检测组织中PCV2。 　25 μL反响体系如下： 　10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL 　10 mmol/L dNTPs 2 μL 　25 pmol/μL上下游引物各 0.5 μL 　DNA模板 2 μL 　Taq DNA聚合酶 0.5 μL 　三蒸水 17 μL 反响程序如下：94 ℃ 变性3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环32次；72℃ 延伸10 min。 　3.琼脂糖凝胶电泳 〔1〕1.5%琼脂糖凝胶的配制：称取1.5g琼脂糖，参加到锥形瓶中，参加100ml电泳液。微波加热4min。 〔2〕制胶：准备好制胶板，待琼脂糖溶液温度下降到60度左右时，将胶液倒入制胶板内。 〔3〕上样：拔去梳子，将凝胶放入电泳槽内，使电泳液浸没凝胶。取8ulPCR产物与1ul的上样缓冲液混匀后，参加凝胶孔内。 〔4〕电泳：加样孔一端置于负极端，翻开电泳仪，电泳30min。由于DNA带负电，所以将会看到样品向正极涌动。 〔5〕观察结果：电泳完毕后，关闭电泳仪，取出凝胶，在紫外灯下观察扩增条带是否与预期大小相同〔本实验中扩增的DNA条带大小为417bp〕。 　提前上网查找提取DNA及PCR扩增原理 　1%红细胞 　1%红细胞 　被检鸡蛋卵黄