槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2生长的影响医学专业.docx

论文题目：槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2生长的影响 摘要 目的： 苦参碱类生物碱是以苦参碱为代表的化学结构相似的一类生物碱，具有清热、燥湿、杀虫、利尿等功效,其作用广泛,效果明显,是抗肿瘤的活性成份, 有研究表明在体外它可诱导K562细胞向红系和粒系分化,可抑制鼠移植性肿瘤生长和诱导SMMC-7721细胞分化。在体内,苦参及其生物碱也有抗肿瘤的报道,并且可治疗肝炎,毒副作用小,还能提高免疫力, 故可能发展成为很好的抗癌新药。 槐果碱是苦参中分离出来的一种苦参碱类生物碱，已被认为是一种强烈的抗病毒及杀虫活性药物。有文献报道，以槐果碱和美法仑为原料，利用拼合原理制备的MAT-MEL对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显增殖抑制作用。然而，槐果碱在肝癌中的作用机制还未完全被发现。另外，有文献表明，槐果碱对正常小鼠有一定的毒性。因此，本实验选取一株肝癌细胞SMMC-7721和一株肝细胞L-O2，同时应用槐果碱作用后分析细胞学习性的改变及其机制，为探索新的抗癌药物提供了科学依据。 方法： （1）先利用不同浓度梯度的槐果碱处理SMMC-7721，根据IC50筛选出两个适当的浓度。 （2）设立对照组，用两个不同浓度的槐果碱同时处理SMMC-7721和L-O2细胞，然后进行镜下观察。 （3）采用MTT实验检测分析两种不同浓度槐果碱对SMMC-7721和L-O2细胞增殖的影响。 （4）采用流式细胞凋亡实验检测两种不同浓度槐果碱作用对SMMC-7721和L-O2细胞凋亡的影响。 （5）采用线粒体膜电位检测两种不同浓度槐果碱作用对SMMC-7721和L-O2细胞线粒体去极化程度。 （6）采用Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase3表达水平差异，分析解释实验结果。 结果： （1） 槐果碱作用SMMC-7721的IC50为536.3（95%CI: 412.7-697.0）。 （2） 选取500mg/L及1000mg/L槐果碱处理细胞后，500mg/L槐果碱浓度下，L-O2及SMMC-7721细胞分布密度明显减少，部分细胞皱缩；1000mg/L槐果碱浓度下，两种细胞分布密度明显降低，并均出现一定程度的细胞皱缩。 （3） MTT结果显示，随着药物浓度的升高，两种细胞OD值均明显下降（P<0.05）；而同浓度下，增殖能力无明显差异（P>0.05）。 （4） 流式细胞术测定结果能够显示，槐果碱作用两种细胞后总凋亡率均随着浓度的升高而增加，但高浓度下肝细胞的促凋亡作用明显高于对肝癌细胞（P<0.05）。 （5） 线粒体膜电位检测结果显示，槐果碱作用两种细胞后线粒体膜电位水平均随着浓度的升高而降低（P<0.05）。 （6） Western blot法结果能够显示，随着槐果碱浓度的升高，两种细胞内Bcl-2水平均减少，Bax及Cleaved-Caspase3蛋白水平均有所升高。 结论：槐果碱能够通过上调肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2细胞内Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达水平并抑制Bcl-2蛋白的表达，达到抑制两种细胞的增殖能力，降低两种细胞的线粒体膜电位水平，并促进细胞凋亡的作用，提示槐果碱在抑制肝癌生长的同时有着不可避免的肝细胞损伤等毒副作用。 关键词：槐果碱；肝；肝癌；增殖，凋亡，体外试验 目 录 第一章 绪论..............................................................................................................................1 1.1 引言....................................................................................................................................1 1.2 研究目的及意义................................................................................................................5 1.3 实验技术............................................................................................................................5 1.4 实验方案设计....................................................................................................................5 1.5 参考文献............................................................................................................................6 第二章 槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2生长能力的影响................................................................................................................................................10 2.1 实验材料.........................................................................................................................10 2.1.1 细胞株......................................................................................................................10 2.1.2 主要试剂..................................................................................................................10 2.1.3 主要仪器..................................................................................................................10 2.2 实验方法.........................................................................................................................11 2.2.1 细胞培养..................................................................................................................11 2.2.1.1 细胞复苏..........................................................................................................12 2.2.1.2 细胞传代培养.................................................................................................12 2.2.1.3 细胞冻存.........................................................................................................13 2.2.2通过显微镜下观察不同浓度槐果碱对肝癌细胞SMMC-7721和肝细胞L-O2细胞形态学的改变清况........................................................................................................................14 2.2.3 MTT实验检测分析不同浓度槐果碱对SMMC-7721和L-O2细胞增殖抑制的影响................................................................................................................................................15 2.2.4 采用流式细胞凋亡实验检测不同浓度槐果碱作用对SMMC-7721和L-O2细胞凋亡的影响....................................................................................................................................16 III 2.2.5 采用线粒体膜电位检测不同浓度槐果碱作用对SMMC-7721和L-O2细胞线粒体去极化程度...............................................................................................................................16 I 2.2.6采用western blot法检测不同浓度槐果碱对肝细胞及肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响..................................................................................................17 2.2.7 统计学处理....................................................................................................17 2.3 实验结果..............................................................................................................17 2.3.1 槐果碱对肝癌细胞增殖能力的影响...........................................................17 2.3.2 槐果碱对肝细胞及肝癌细胞增殖抑制作用的比较...................................18 2.3.3 槐果碱对肝细胞及肝癌细胞凋亡影响的比较...