2023年重组质粒的构建经验.docx

重组质粒的构建经验~~~ 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计pcr引物时，引入酶切位点后，常常要参加保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所无视。这种无视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只参加两个保护碱基，其内切反响就可以正常进行；而有一类，仅仅只参加两个保护碱基，其内切反响就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合dna片段上。如ndei就属这类，需要参加至少6个保护碱基，常用的hindiii也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信以下将有助于大这家的实验设计。ncoi4ndei6nhei3noti8pmei6saci3sali3smai3hindiii3bsti8sphi4xhoi3xbai3smai4案例分析一：本人最初曾选用ndei克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计pcr引物时，引入ndei酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在ndei序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说假设一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。 二、载体酶切的问题 1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择ndei和hindiii作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；假设不能，就按“一〞中原那么进行调换。 2、连接反响的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源dna片段的连接反响。成功与否，很大程度上取决于与质粒和dna片段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致局部的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反响中，即使在外源dna片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反响中，在不参加外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒dna必须重新进行双酶切。实验案例分析2：本人曾用xhoi和hindiii酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现xhoi酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用kpni和hindiii构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后疑心kpni酶失效。迁怒kpni，在我不知情下扔掉实验室所有kpni酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定hindiii位点失效。最后他责备本人暗中保存一手，没 有倾攮相授。呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵，你说冤不冤。这世道啊。也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。 三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：2023为宜。做好“ 一、二〞，16℃2023小时后，每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司〞的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。这里介绍一个估测处dna浓度的方法：dna可以用紫外法检测，也可以电泳比照marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法： 1.取一平皿。 2.薄薄倒一层含有eb的琼脂糖胶，凝固（4℃可以存一个星期）。 3.平皿反面可以画成小方格。 4.一小格中点1ul样品。 5.另一小格格点1uldna标准品（我一般用takara2022dnalander，1ul相当60ng）6.凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。ok，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：2023都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。 第二篇：基因重组质粒的构建与抽提基因重组质粒的构建与抽提 ....................................................................................................................................................Ⅰabstract............................................................................................................................................Ⅱ引言.......................................................................................................................................................11材料与仪器、用品.........................................................................................................................22原理与方法......................................................................................................................................3 2.1获取目的基因.......................................................................................................................3 2.1.1提取rna.................................................................................................................32.1.2rna反转录为cdna............................................................................................32.1.3聚合酶链式反响......................................................................................................42.2回收目的基因.......................................................................................................................5 2.2.1核酸电泳....................................................................................................................52.2.2胶回收........................................................................................................................62.3dna分子体外连接.............................................................................................................72.4转化.......................................................................................................................................72.5抽提鉴定质粒.......................................................................................................................83讨论...............................................................................................................................................20233.1试剂.....................................................................................................................................113.2核酸酶................................................................................................................................113.3核酸电泳缓冲液...............................................................................................................113.4胶回收效率........................................................................................................................113.5dna酶切位点................................................................................