2023年银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测.doc

目录 第一章绪论 4 1.1银杏叶成效成分简述 4 1.2 银杏叶主要成分研究情况 4 1.3黄酮类化合物 4 〔1〕组成及结构 4 〔5〕 银杏黄酮类化合物的理化性质 5 第二章理论分析 6 2.1银杏叶采集分析 6 2.2 提取分析 6 第三章实验仪器及其材料 7 第四章实验方法及其过程 7 4.1银杏叶采集、枯燥 7 4.2银杏叶中黄酮等物质的提取 7 4.3细菌培养 8 4.4制作菌悬液 9 4.5提取物的抑菌性检测实验 9 第五章实验结果分析 10 第六章结论 14 银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测 摘 要 银杏是我国的特有植物，又称公孙树。银杏叶为最古老的中生代孑遗植物银杏的枯燥叶。银杏有裸子植物活化石之称。据本草纲目记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用。在医药上有很高的利用价值。银杏所含黄酮类成分主要为银杏双黄酮、异银杏双黄酮，去甲基银杏双黄酮，其他还有二萜内酯、银杏内酯A、B、C等，其中黄酮类和二萜内酯类物质具有捕获游离基和抑制血小板活化因子、扩张脑血管、促进血液循环、抗氧化等功能，从而广泛用于治疗冠心病、心绞痛、治疗老年痴呆症和增强记忆功能、防治皮肤病、脱发等多种疾病，随着深入的研究银杏的开发和利用，银杏所特有的医药、经济价值逐步受到重视。银杏叶的提取方法有有机溶剂萃取法、水提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、超临界萃取法、超声波提取法、酶法等。本文采用有机溶剂提取黄酮类化合物，结果说明实验证明提取银杏叶黄酮等物质用乙醚3小时提取70℃下2次回流最正确。菌体浓度试验说明当实验用菌体浓度在OD值为0.557，稀释到10-5和10-6比拟适合，涂布能够成为单菌落，便于以后进行试验。提取抑菌性试验证明参加0.5ml时对大肠杆菌就有明显抑制作用，其抑菌效果随着提取物浓度的增加而增强，当提取物参加2.0ml时具有完全抑菌效果。 关 键 词：银杏叶，总黄酮，乙醇，抑菌性检测 第一章绪论 1.1银杏叶成效成分简述 银杏树是目前发现的当今世界上最奇特1.5倍行距 、对人类奉献最大的植物，特别是银杏叶具有五大成分五大成效，银杏叶将是世界上最有开展前景的中药材，能够治疗世界上很多的疑难杂症： 〔1〕黄酮苷类：对心脑血管疾病，高血脂，高血压，去除氧自由基具有显著的疗效，是目前世界上治疗该类疾病最显著的药物。 〔2〕银杏内酯A、B、C、M类：是血小板活化因子〔PAF〕拮抗剂，是银杏叶中最重要的活性成分，是治疗神经系统疾病的特效药物。 〔3〕白果内酯类：白果内酯有很强的生物活性，为神经精神病药物，对因年老的呆傻症有奇异的疗效，它能抗神经末梢的衰老，被誉为真正抗衰老化学物质。 〔4〕银杏酚酸类：可促进胃液和胆汗的分泌；具有抗细菌和消炎的作用；制成无残留农药；含有抗真菌物质，能够真正刺激促进造神经中枢系统的作用。 〔5〕聚异戊烯醇类：血功能，改善肝脏机能，对再生障碍性贫血〔白血病〕，对各种肝病、糖尿病具有最显著的疗效，是治疗这类疾病最具有开发前景的药物。 1.2 银杏叶主要成分研究情况 自20世纪60年代开始，许多国家采用现代别离技术对银杏叶的化学成分进行研究，经药理实验和临床验证，发现银杏叶的多方面生物活性与其所含特定化学成分有关。德国Willamar Schwabe首次注册了银杏叶的一种简单提取物，并于1972年申请了专利〔W Schwabe DE 176708和DE 2117429〕，定名为EGb761，将其用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病，具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物〔ginkgolides〕具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物具有增强血小板活化因子〔PAF〕拮抗的作用。将银杏制剂列为治疗药物的国家有德国、法国和中国，其他国家均只将其用为保健食品或非处方用药。美国开发出的银杏保健食品已经获得FDA的批准，使人们对银杏叶的保健药用价值更加重视，对银杏叶化学成分研究也越来越深入。最近不断从银杏叶中发现一些新的生物活性成分。 1.3黄酮类化合物 〔1〕组成及结构 黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环〔A-与B-环〕通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其根本母核为2-苯基色原酮。银杏叶中黄酮类化合物(flavonoids)可分为黄酮、双黄酮和儿茶素等三类化合物，共有36种，主要以苷的形式存在，是银杏叶的主要药理成分之一，含量较高，在银杏叶中含量变化较大。据对贵州等地330份样品及银杏叶生产发育期间黄酮苷含量的检测分析说明：不同地区、各单株之间变化幅度在0.2%～2.74%；叶中黄酮苷含量＞0.8%者占测定数的48.0%；不同生育期间叶中黄酮苷含量相差2倍左右，4月份含量最高，4～6月份呈下降趋势，6至10月含量变化不明显。 〔2〕银杏黄酮： 银杏黄酮的苷元有7种，即槲皮素〔quercetin〕、山奈素〔kaempferol〕、异鼠李素〔isorhamnetin〕、杨梅素〔myricetin〕、芹菜素〔apigenin〕、木犀草素〔luteolin〕、三粒小麦黄酮〔tricetin〕等，前三种是其主要成分。银杏叶及其提取物〔GBE〕的质量控制中主要检测这三种黄酮苷元的含量。 〔3〕双黄酮： 银杏叶中的双黄酮是由两分子黄酮母核通过C—C键聚合而成的一类化合物，一共有6种。 〔4〕儿茶素类：儿茶素类化合物具有治疗肝中毒的作用和抗肿瘤活性。银杏叶中的儿茶素类化合物有6种。 〔5〕 银杏黄酮类化合物的理化性质 黄酮类为酚性成分，属多环多元酚类，由于含有苯并γ-吡酮而形成β-烯醇酮〔β-enolone〕结构，这种烯醇酮结构所表现的特性是黄酮分子中的酚羟基的弱酸性与铁盐的显色反响；还能与铝形成配合物，使光吸收长移，显较深的颜色，可用于鉴定黄酮类化合物〔即铝盐比色法〕；同时酚羟基具有复原性，表现在提取加工过程中的氧化变色，在提取别离时可参加复原剂进行保护。 银杏黄酮类化合物的苷元多为结晶体、苷多为无定性粉末。黄酮苷类由于在结构中引入糖基，故均有旋光性，且多为左旋。银杏黄酮、黄酮醇及其苷类子含有7，4ˊ-位助色团，颜色为深黄色；在紫外光下产生荧光，可用于银杏黄酮类化合物的定性检验。 银杏黄酮类化合物的苷元一般难溶于或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。银杏黄酮苷与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯中，难溶于乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂。银杏黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显弱酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等。 第二章理论分析 2.1银杏叶采集分析 银杏秋季黄叶药用有效成份的含量，是春季绿叶的3.6倍，是夏季绿叶的4.1倍，是秋季绿叶的1.1倍。由此可见，采摘银杏叶的最正确时间，应是霜降前的10—15天，即10月上、中旬。这样，一方面不会影响银杏树的生长，另一方面也最大限度地保证了叶片的利用价值。 因此在采集时要把当时的绿叶和黄叶分好标明，同时也要用细绳测出树干周长，以便估算出树龄。 2.2 提取分析 〔1〕溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备根底上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附．洗脱法。以60％丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最正确萃取条件为萃取5 min温度60℃4次，萃取物中黄酮苷含量为57％。V水：V正丙醇=1:25最正确。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80％乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH值为3—4酸水和酸性25％乙醇洗涤，75％乙醇洗脱，喷雾枯燥。 〔2〕超临界流体萃取法(SFE法)：利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行别离纯化的操作。最正确萃取实验工艺条件为萃取压力15 MPa、乙醇浓度90％、萃取温度55℃，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想。 〔3〕高速逆流色谱技术提取法：是一种不用任何固定载体的液一液分配色谱技术W=70%的乙醇连续循环喷淋逆流6级萃取，m乙醇：m银杏叶=5:1，总萃取时间240min,萃取温度50~55度，萃取率99%以上。 〔4〕微波提取法：微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多及热效率较高，升温快速均匀，大大缩短了提取时间，提高了萃取效率。以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理。 〔5〕超声提取法：超声技术应用于天然活性产物的提取，具有速度快、提取率高、节省溶剂、节约能耗、不破坏有效成分的特点。最正确操作条件为超声波频率40kHz处理时间10min、静置时间12 h。以水为介质，在较低温度下。 〔6〕酶提取法: 参加淀粉局部水解产物及对葡糖基有转移作用的葡糖苷酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性苷糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体内的吸收. 在常规的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理(酶解时间为2h)。 〔7〕分子烙印技术: 在极性溶剂中，以丙烯酞胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物(MIP) MIP对槲皮素具有特异的亲合性，将该MIP直接用于别离银杏叶提取物水解液。 第三章实验仪器及其材料 仪器：研钵、电子天平、索氏提取器、水浴锅、锥形瓶、量筒、平皿、移液管、试管、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台。 材料、试剂：银杏叶、60%乙醇、70%乙醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、石油醚。 第四章实验方法及其过程 4.1银杏叶采集、枯燥 〔1〕银杏叶采集于2023年9月初河北化工医药职业技术学院内，直径10cm，树龄20年左右，雌株。 〔2〕采集后的银杏叶于60℃烘干至恒重，置于研钵中碾压成粉末状用于之后实验。 4.2银杏叶中黄酮等物质的提取 〔1〕乙醇提取 用电子天平称取银杏粉末10g，置于索氏提取器中参加70%乙醇60ml，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml70%乙醇，于水浴锅中70℃—80℃恒温加热回流两次，蒸馏回收乙醇，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50％一70％时,提取率随浓度增加提高，当浓度70％时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80℃时提取率达最大。 〔2〕石油醚提取 用电子天平称取银杏粉末10g，置于索氏提取器中参加石油醚70ml，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml石油醚，于水浴锅中70℃—80℃恒温加热回流两次，蒸馏回收石油醚，得银杏叶黄酮提取物。 〔3〕提取过程结束后将两组提取物置于水浴锅中蒸干。 4.3细菌培养 〔1〕培养基的制备 培养基配方: 牛肉膏0.3g ，蛋白胨1.0g，氯化钠 0.5g，琼脂 1.5g， 水 100ml  要配置2023ml培养基，称取牛肉膏3 g 两份，蛋白胨10 g 两份，琼脂15 g 两份，分别参加到1000ml大烧杯中。加蒸馏水至1000ml搅拌摇匀。后用氯化钠和盐酸调节ph至7.0.。分装于4只锥形瓶中。 〔2〕所用仪器的灭菌 用报纸将所用到的仪器包好，平皿12个，移液管7只，培养基500ml，10ml无菌水试管6只，涂布器4个。再将包好的仪器放入高压蒸汽灭菌锅中120℃灭菌30分钟。 正确的操作流程：检查水位→加水→摆放物品→盖锅盖→接通电源→设置杀菌温度和时间→点击“work〞工作按钮→杀菌〔升温→保温→降温〕→切断电源→开盖取出物品。 操作本卷须知：加水不可过多，不超过锅内平台，防止浸湿物品；每次杀菌前一定要检查水位；盖锅盖时应该对称拧紧三对螺母，防止一顺操作