2023年金诃牌雪益康胶囊急性毒性和遗传毒性试验研究.docx

金诃牌雪益康胶囊急性毒性和遗传毒性试验研究 刘有菊 马文俊 袁发荣 孙跃宁 陈海莲 ：目的：研究金诃牌雪益康胶囊的急性毒性和遗传毒性实验，评价其食用平安性。方法：依据食品平安性毒理学评价程序和方法进行急性毒性试验、遗传毒性试验〔Ames 试验、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验〕。结果：小鼠急性毒性试验经口最大耐受剂量〔MTD〕>30 g/kg·bw，属无毒级。Ames 实验、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验结果均为阴性，说明受试物无致突变作用。结论：金诃牌雪益康胶囊急性毒理分级属无毒级，无遗传毒性，在本试验剂量范围内，金诃牌雪益康胶囊属于平安性保健食品。 关键词：金诃牌雪益康胶囊；急性毒性；遗传毒性； 金诃牌雪益康胶囊产品配方精选海拔3000米左右高原特色草本植物唐古特白刺果、柴达木枸杞果、沙棘果等为主要原料制成的保健食品。优越的地理环境，日照时间长，太阳辐射强，昼夜温差大，培育出高活性的高原物质。以传统医学与现代养生理论为指导原那么，六种植物科学配伍、合理配比，采用传统炮制与现代工艺相结合的技术手段，精制而成的一款高端产品，其主要保健功能是调节血糖。 为评价产品的平安性，根据保健食品检验与评价技术标准的要求，现进行金诃牌雪益康胶囊的急性毒性及遗传毒性试验。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 受试样品 金诃牌雪益康胶囊由金诃藏药股份提供。样品推荐量为每日3次，每次3-4粒，0.3g/粒，总量为3.6g，相当于成人推荐量0.06g/kg·bw〔以60kg计〕。 1.1.2 实验动物和饲养环境 KM种小鼠，清洁级，体重18-22g，动物合格证号：青医动字第001号，由青海省实验动物中心提供；实验动物购进后首先于恒温恒湿的动物房环境中适应3天，单笼饲养。 1.1.3 菌株 鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100 、TA102。由上海市疾病预防控制中心提供。 1.1.4 主要儀器 超净工作台、电子天平、压力蒸汽灭菌器、HH-6数显恒温水浴锅〔常州澳华仪器〕、培养箱、恒温电热鼓风枯燥箱。 1.2 方法 1.2.1 急性毒性试验 按最大耐受量试验方法进行，取健康KM种小鼠40只，体重18-22g/只，雌雄各半。于正式试验前晚禁食不禁水16h，次日，用经过三次预试后确定的30g/kg剂量，经口灌胃给药后，观察两周，记录小鼠中毒表现、死亡情况。 1.2.2 Ames试验 试验按照平板掺入法，经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株进行试验；受试样品设5个剂量组：8、40、200、1000、5000ug/皿，同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。按保健食品检验与评价技术标准〔2003 年版〕中鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验中平板掺入法，在保温的45℃ 2mL 顶层培养基中，依次参加0.1mL受试物、0.1mL 菌株增菌液，需活化时参加 0.5mL S9混合液，充分混匀迅速倾倒底层平板，做3个平行平板。37℃培养 48h，计数回变菌落数，试验重复一次。如果受试物的回变菌落数增加超过自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量反响关系者，即为诱变试验阳性。 1.2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 健康KM种小鼠50只，体重25-30g/只，随机分为5组，雌雄各半，10只/组。根据急性毒性实验LD50值，设3个受试物组〔1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50〕即15.00、7.50、3.75g/〔kg·BW〕3 个样品剂量组，分别称取金诃牌雪益康胶囊15.00、7.50、3.75g，加蒸馏水20ml溶解待用，另设40mg/〔kg·BW〕环磷酰胺为阳性对照组、离子水阴性对照组；给药后各组均间隔24h灌胃0.20ml/10g体重，于末次灌胃给药后6h脱颈椎处死，取双侧股骨，滴加1滴小牛血清，制成细胞悬液，涂片制片，油镜下选择细胞分散好、形态完整、染色良好部位，按一定顺序进行计数。计数嗜多染红细胞〔PCE〕及带微核的细胞〔MNPCE〕共1000个，每只小鼠计数微核的千分率。 1.2.4 小鼠精子畸形试验 选25-30g/只健康KM种雄性小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药组按1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50，40mg/ kg·bw环磷酰胺阳性对照组、阴性对照组〔离子水〕，各组雄性小鼠按照相应的剂量，分别连续灌胃5d后，喂养观察30d。于第35d处死小鼠，取两侧副睾的精子涂片精子，按规定涂片制成。观察计数各组小鼠完整精子1000个，计算精畸率。 1.3 统计学处理 2. 结果 2.1 金诃牌雪益康胶囊对小鼠急性毒性试验的结果 经观察两周，雌雄两组动物均未发现中毒病症、异常反响，生长良好，观察期未见死亡。于实验末，安乐法处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。金诃牌雪益康胶囊对小鼠急性毒性试验LD50>30g/ kg·bw。根据急性毒性分级标准，属无毒级。见表1： 2.2 金诃牌雪益康胶囊Ames试验结果 由表2、表3可见，经两次Ames实验，5个剂量组回变菌落数与自发回变菌落数相比拟，四种菌株在加与不加S-9的条件下，均无显著性差异；而阳性对照回变菌落数高于阴性对照组回变菌落数的2倍以上。说明红珍珠牌“雪之健〞胶囊无致突变作用。 2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 由表4可见，金诃牌雪益康胶囊高、中、低剂量组与空白对照组比拟，微核千分率均无统计学意义〔P>0.05〕，而环磷酰胺组微核率那么显著高于空白对照组，有统计学意义〔P<0.01〕。说明金诃牌雪益康胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显影响，检测结果为阴性。 2.4 小鼠精子畸形试验 由表5可见，红珍珠牌雪之健各剂量组小鼠精子畸形率与空白组比拟，小鼠精子畸形率无显著性差异〔P>0.05〕，而环磷酰胺组与空白组比拟，小鼠精子畸形率明显升高，差异有统计学意义〔P<0.01〕。 3. 讨论 高血糖是指患者血中糖的含量长期持续超过正常水平，它的判断标准主要为血糖值。短时间内一次性的高血糖对人体无严重损害，而长期的高血糖会使全身各个组织器官发生病变，其主要原因归咎于糖尿病慢性并发症。现已确认慢性并发症与长期代谢控制不佳有关。对其发生机制的解释是由于胰岛素缺乏所致细胞内糖、脂、蛋白质代谢紊乱。大量临床动物研究结果说明：在一些易致糖尿病并发症的组织如神经、肾、视网膜、晶体中，葡萄糖的摄取、利用并不依赖胰岛素，细胞内的葡萄糖浓度与体液内一样高。长期血糖过高能直接损害这些组织。 金诃牌雪益康胶囊配方原料-白刺果生长在青海柴达木盆地，古称“唐古特〞产区的白刺果为蒺藜科白刺属灌木。成熟的白刺果实晶莹剔透，红的像珍珠，紫的似玛瑙，人们亲切地称之为“高原红珍珠〞。据本草纲目记载的白刺，疗丈夫虚损，阳痿精自出，补肾气，益精髓。藏医精髓与医学宝典“白刺果可入药，健脾胃、滋补强身、舒经活血，主治肺病和胃病，果核可榨油。〞 富含总黄酮、氨基酸、生物碱、脂肪酸、维生素、多种矿物质及微量元素。研究说明，唐古特白刺果实对多种高血糖动物模型具有较好的降血糖作用。枸杞含有枸杞多糖、类胡萝卜素、甜菜碱、维生素、微量元素等人體所必需的营养成分。枸杞水提取物可明显降低正常小鼠的血糖，对肾上腺素、四氧嘧啶所致〔模型〕小鼠高血糖亦具有明显抑制作用，且有量效关系。被世界植物群体中公认的Vc之王，因其果实含有人体不能合成的多种维生素，故有“天然维生素宝库〞之称的沙棘，富含维生素、黄酮类及多酚类、不饱和脂肪酸、植物甾醇类及植物固醇、微量元素等；沙棘果中黄酮能体外去除自由基及抗脂质过氧化，对正常小鼠的血糖具一定的降低作用。麦芽为禾本科植物大麦的成熟果实经发芽枯燥的炮制加工品。麦芽含淀粉酶、转化糖酶、维生素B、脂肪、磷脂、糊精、麦芽糖、葡萄糖等；大剂量麦芽可调整血糖、血脂水平，明显降低血浆游离脂肪酸，升高血清瘦素水平。山楂含有黄酮类、有机酸、磷脂、维生素等。山楂总黄酮可通过抑制肾组织TGF-β1和CTGF的过度表达，从而对2型糖尿病肾病具有保护作用。山药含有薯蓣皂苷元、山药多糖、山药碱、氧化酶、糖蛋白、多种甾醇类物质等。山药多糖能降低四氧嘧啶所致大鼠的血糖水平，其降糖作用随着给药剂量的增加而增加。 研究说明，金诃牌雪益康胶囊能明显降低四氧嘧啶所引起的高血糖模型大鼠的空腹血糖水平。 作者简介： 刘有菊〔1987-〕，研究实习员，主要从事藏药新药及保健食品的研究开发。 基金工程： 藏药新药开发国家重点实验室〔NO.2023DQ870717〕；青海省藏药新药开发重点实验室〔NO.2023-ZJ-Y15〕