2023年一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的凝结芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的确定.doc

一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的凝结一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的凝结芽孢杆菌的分离、鉴定及其发酵条件的芽孢杆菌的分离、鉴定及其发酵条件的确定确定 佟德军 徐建志 徐洁 戎晓平 万俊康 贾佩峤 摘 要：从池塘养殖鲤鱼中分离出一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的芽孢杆菌，经 16S rDNA 比对鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。经液相色谱方法检测其发酵上清液对玉米赤霉烯酮的 24、48 h 降解能力分别为 62%和 84%。经发酵实验得到此株凝结芽孢杆菌的最适生长条件为：40，pH 值 6.4，经36 h 好氧液体发酵可得 25.9 亿个/mL 的活菌数，最佳液体培养基为：蛋白胨15，酵母粉 5，玉米粉 15，葡萄糖 20，麸皮 10。综合实验结果，此株凝结芽孢杆菌可作为饲料添加剂用于饲料中霉菌毒素的降解和提高动物抗病能力。关键词：玉米赤霉烯酮;凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）;饲料安全;霉菌毒素 随着我国养殖业包括水产养殖业对饲料的需求量逐年增加，与饲料中霉菌毒素相关的食品安全也越来越受到重视1-2。乳酸作为小分子有机酸在进入动物肠道后可以有效提高动物对病原菌的抵抗能力3。对饲料中霉菌毒素的处理方式从蒙脱石等无机矿物质的吸附到酵母细胞壁等生物源物质的吸附，再到在饲料里添加可以降解霉菌毒素的活菌制剂及其代谢产物4，对霉菌毒素的降解效率越来越高。目前生产中使用的具有降解霉菌毒素能力的微生物多数为枯草芽孢杆菌，筛选同时具有降解霉菌毒素和产乳酸的菌株对提高动物抗病能力和减轻饲料中霉菌毒素的危害具有重要意义。1 材料与方法 1.1 主要试剂及检测服务商 枯草芽孢杆菌（购自市场，用于阳性對照）。对玉米赤霉烯酮的降解能力按照国标 GB/T 28716-2012 检测5。菌株 16S rDNA 序列测定由上海迈浦生物科技有限公司完成。1.2 实验方法 1.2.1 菌株筛选与鉴定 原始样品采集于河北省乐亭县某养殖池塘。将捕捞上来的鲤鱼用无菌剪刀取出内脏，置于灭菌纱布上，并放置于碎冰上。以无菌操作取肠道内容物，以无菌生理盐水 10 倍稀释后，倾注法在添加 5 CaCO3 的 MRS平板 37 培养，逐日观察菌落情况和形成的水解圈情况。对具有产酸能力的菌株，挑取单菌落接种入 MRS 液体培养基三角瓶培养。在指数期停止培养，培养液离心，取上清液测定其玉米赤霉烯酮毒素在 24、48 h 的降解率。对同时具有产酸和降解毒素能力的菌株，经纯化培养后进行 16S rDNA 序列测定，将测序结果同 NCBI 数据库进行比对，确定菌株分类地位。1.2.2 最优发酵条件的确定 对鉴定出的菌株采用正交试验法设计实验方案（表1），每配方 3 个重复，进行摇瓶发酵实验。2 结果与分析 共筛选得到 8 株可以在添加 CaCO3 的 MRS 平板上形成水解圈的菌株、1 株对玉米赤霉烯酮具有降解能力的菌株。将同时具有降解玉米赤霉烯酮能力和产酸能力的此株细菌编号为 320。菌株 320 在 MRS 平板上的菌落特征为：表面褶皱，暗黄色，直径 13 mm，不产色素，在含有碳酸钙的平板上能产生明显的水解圈。16S rDNA 测序结果与 NCBI 数据库通过 BLAST 比较，与凝结芽孢杆菌具有 99%相似性，故定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。经正交实验结果比较可知，菌株 320 最适三角瓶液体培养基配方为：蛋白胨15，酵母粉 5，玉米粉 15，葡萄糖 20，麸皮 10，极差法分析可知培养基中对发酵菌数影响力大小为：麸皮葡萄糖玉米面蛋白胨酵母浸粉。3 结论 由鲤鱼肠道筛选到的这株凝结芽孢杆菌 320 菌株同时具有产酸和降解玉米赤霉烯酮的能力，可用于饲料添加剂。其最适摇瓶发酵配方为：蛋白胨 15，酵母粉 5，玉米粉 15，葡萄糖 20，麸皮 10;最适条件下培养 36 h 后有效活菌数可达到 25.9108 CFU/mL。凝结芽孢杆菌 320 菌株可用于饲料添加，以提高动物抗病力和降低饲料中霉菌毒素的危害。参考文献：1 杨丽梅，申光荣.饲料中霉菌毒素的危害及其预防J.饲料工业，2003，24（12）：53-55.2 彭宏宇，刘立鹤.水产饲料中霉菌毒素对渔类的影响及解决策略J.当代畜牧，2019（05）：67-70.3 黄燕华，周晓波，王国霞，等.5 种乳酸菌对奥尼罗非鱼免疫和抗病力的影响J.水产科学，2014，33（10）：601-605.4 王丽娜，周盛昌.防霉剂和脱霉剂在饲料中的应用J.今日养猪业，2019（05）：100-101.5 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法：GB/T 28716-2012S.北京：中国标准出版社，2012.（收稿日期：2020-10-15;修回日期：2020-11-05）