HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 347.22018 部分代替 HJ/T 3472007 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 Water qualityDetermination of fecal coliformManifold zymotechnics 2018-12-26 发布 2019-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 347.22018 i 中华人民共和国生态环境部 公 告 2018 年 第 73 号 为贯彻中华人民共和国环境保护法，保护生态环境，保障人体健康，规范生态环境监测工作，现批准水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法等五项标准为国家环境保护标准，并予发布。标准名称、编号如下。一、水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法（HJ 347.12018）；二、水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法（HJ 347.22018）；三、水质 细菌总数的测定 平皿计数法（HJ 10002018）；四、水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法（HJ 10012018）；五、水质 丁基黄原酸的测定 液相色谱-三重四极杆串联质谱法（HJ 10022018）。以上标准自 2019 年 6 月 1 日起实施，由中国环境出版集团出版，标准内容可在生态环境部网站（ 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 3472007）废止。特此公告。生态环境部 2018 年 12 月 26 日 HJ 347.22018 iii 目 次 前 言.iv 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 干扰和消除.1 6 试剂和材料.2 7 仪器和设备.2 8 样品.3 9 分析步骤.3 10 结果计算与表示.5 11 精密度和准确度.5 12 质量保证和质量控制.6 13 废物处理.6 附录 A（资料性附录）最大可能数（MPN）表.7 附录 B（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告推荐格式.11 HJ 347.22018 iv 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的多管发酵法。本标准是对水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 3472007）多管发酵法部分的修订。本标准首次发布于 2007 年，原起草单位为中国环境监测总站。本次为第一次修订。本次修订的主要内容如下：完善了方法原理的表述；增加了 12 管法和 15 管法的检出限；分析步骤中增加了 12 管法，完善了样品稀释方法；增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节；将 MPN 表移至附录中。自本标准实施之日起，水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 3472007）废止。本标准的附录 A 和附录 B 为资料性附录。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、沈阳市疾病预防控制中心和辽宁北方环境检测技术有限公司。本标准生态环境部 2018 年 12 月 26 日批准。本标准自 2019 年 6 月 1 日起实施。本标准由生态环境部解释。HJ 347.22018 1 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 1 适用范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的多管发酵法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。本方法的检出限：12 管法为 3 MPN/L；15 管法为 20 MPN/L。2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 494 水质 采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms）。44.5培养 24 h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。3.2 最大可能数 most probable number（MPN）又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。4 方法原理 将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。44.5复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查 MPN 表，得出粪大肠菌群浓度值。5 干扰和消除 5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.7）消除干扰。HJ 347.22018 2 5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.8）消除干扰。6 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。6.1 乳糖蛋白胨培养基。蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1 ml 将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于 1 000 ml 水中，调节 pH 至 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1 ml，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中，115高压蒸汽灭菌 20 min，储存于冷暗处备用。也可选用市售成品培养基。6.2 三倍乳糖蛋白胨培养基：称取三倍的乳糖蛋白胨培养基（6.1）成分的量，溶于 1 000 ml 水中，配成三倍乳糖蛋白胨培养基，配制方法同上。6.3 EC 培养基。胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 将上述成分或含有上述成分的市售成品加热溶解于 1 000 ml 水中，然后分装于有玻璃倒管的试管中，115高压蒸汽灭菌 20 min，灭菌后 pH 应在 6.9 左右。注：配制好的培养基（6.16.3）避光、干燥保存，必要时在 53冰箱中保存，通常瓶装及试管装培养基不超过 36 个月。配制好的培养基要避免杂菌侵入和水分蒸发，当培养基颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。6.4 无菌水：取适量实验用水，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。6.5 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。6.6 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。6.7 硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/ml 称取 15.7 g 硫代硫酸钠（6.5），溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。6.8 乙二胺四乙酸二钠溶液：（C10H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/ml 称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.6），溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液可保存 30 d。7 仪器和设备 7.1 采样瓶：500 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。7.2 高压蒸汽灭菌器：115、121可调。7.3 恒温培养箱或水浴锅：允许温度偏差 370.5、440.5。7.4 pH 计：准确到 0.1 pH 单位。HJ 347.22018 3 7.5 接种环：直径 3 mm。7.6 试管：300 ml、50 ml、20 ml。7.7 一般实验室常用仪器和设备。注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min 备用。8 样品 8.1 样品采集 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。清洁水体的采样量不低于 400 ml，其余水体采样量不低于 100 ml。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面 1015 cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.7），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.8），以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml的乙二胺四乙酸二钠溶液）。注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.5）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。8.2 样品保存 采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于 4以下冷藏并在 2 h 内检测。9 分析步骤 9.1 样品稀释及接种 9.1.1 15 管法 将样品充分混匀后，在 5 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基（6.2）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品 10 ml，在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基（6.1）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品 1 ml，在 5 支装有已灭菌的 10 ml 单倍乳糖蛋白胨培养基（6.1）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品 0.1 ml。对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释 104倍，然后按照上述操作步骤分别接种 10 ml、1 ml 和 0.1 ml。15 管法样品接种量参考表见表 1。当样品接种量小于 1 ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。按无菌操作要求方式吸取 10 ml 充分HJ 347.22018 4 混匀的样品，注入盛有 90 ml 无菌水（6.4）的三角烧瓶中，混匀成 110 稀释样品。吸取 110 的稀释样品 10 ml 注入盛有 90 ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成 1100 稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。注：吸取不同浓度的稀释液时，每次必须更换移液管。生活饮用水等清洁水体也可使用 12 管法。表 1 15 管法样品接种量参考表 接种量/ml 样品类型 10 1 0.1 102 103 104 105 水源水 湖泊（水库）地表水 河流 生活污水 处理前 废水 工业废水 处理后 地下水 9.1.2 12 管法 将样品充分混匀后，在 2 支装有已灭菌的 50 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基（6.2）的大试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品 100 ml，在 10 支装有已灭菌的 5 ml 三倍乳糖蛋白胨培养基（6.2）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品 10 ml。9.2 初发酵试验 将接种（9.1）后的试管，在 370.5下培养 24 h2 h。发酵试管颜色变