HJ 1000-2018 水质 细菌总数的测定 平皿计数法.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 10002018 水质 细菌总数的测定 平皿计数法 Water qualityDetermination of total bacteriaPlate count method 2018-12-26 发布 2019-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 10002018 i 中华人民共和国生态环境部 公 告 2018 年 第 73 号 为贯彻中华人民共和国环境保护法，保护生态环境，保障人体健康，规范生态环境监测工作，现批准水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法等五项标准为国家环境保护标准，并予发布。标准名称、编号如下。一、水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法（HJ 347.12018）；二、水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法（HJ 347.22018）；三、水质 细菌总数的测定 平皿计数法（HJ 10002018）；四、水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法（HJ 10012018）；五、水质 丁基黄原酸的测定 液相色谱-三重四极杆串联质谱法（HJ 10022018）。以上标准自 2019 年 6 月 1 日起实施，由中国环境出版集团出版，标准内容可在生态环境部网站（ 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 3472007）废止。特此公告。生态环境部 2018 年 12 月 26 日 HJ 10002018 iii 目 次 前 言.iv 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 干扰和消除.1 6 试剂和材料.1 7 仪器和设备.2 8 样品.2 9 分析步骤.3 10 结果计算与表示.3 11 精密度和准确度.4 12 质量保证和质量控制.5 13 废物处理.5 附录 A（资料性附录）细菌总数检验记录及报告推荐格式.6 HJ 10002018 iv 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水中细菌总数的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的平皿计数法。本标准的附录 A 为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、沈阳市疾病预防控制中心和辽宁北方环境检测技术有限公司。本标准生态环境部 2018 年 12 月 26 日批准。本标准自 2019 年 6 月 1 日起实施。本标准由生态环境部解释。HJ 10002018 1 水质 细菌总数的测定 平皿计数法 1 适用范围 本标准规定了测定水中细菌总数的平皿计数法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的测定。2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 494 水质 采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 细菌总数 total bacteria 36培养 48 h，样品在营养琼脂上所生长的需氧菌和兼性厌氧菌菌落总数。3.2 菌落形成单位 colony-forming units（CFU）单位体积样品中的细菌群落总数。4 方法原理 将样品接种于营养琼脂培养基中，在特定的物理条件下（36培养 48 h）培养，生长的需氧菌和兼性厌氧菌总数即为样品中细菌菌落的总数。5 干扰和消除 5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.5）消除干扰。5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.6）消除干扰。6 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏水或去离HJ 10002018 2 子水。6.1 营养琼脂培养基。成分：蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 琼脂 1520 g 将上述成分或含有上述成分的市售成品溶解于 1 000 ml 水中，调节 pH 至 7.47.6，分装于玻璃容器中，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，储存于冷暗处备用。避光、干燥保存，必要时在 53冰箱中保存，不得超过 1 个月。配制好的营养琼脂培养基不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变化或脱水明显时应废弃不用。6.2 无菌水：取适量实验用水，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。6.3 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。6.4 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。6.5 硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/ml 称取 15.7 g 硫代硫酸钠（6.3），溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。6.6 乙二胺四乙酸二钠溶液：（C10H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/ml 称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.4），溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液可保存为 30 d。6.7 玻璃珠：直径 38 mm。7 仪器和设备 7.1 采样瓶：250 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。7.2 高压蒸汽灭菌器：115、121可调。7.3 恒温培养箱：允许温度偏差 361。7.4 恒温水浴锅：47可调。7.5 pH 计：准确到 0.1 pH 单位。7.6 放大镜或菌落计数器。7.7 一般实验室常用仪器和设备。注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min 备用。8 样品 8.1 样品采集 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面 1015 cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。HJ 10002018 3 采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.5），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.6），以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml 乙二胺四乙酸二钠溶液）。注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.3）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。8.2 样品保存 采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于 4以下冷藏并在 2 h 内检测。9 分析步骤 9.1 样品稀释 将样品用力振摇 2025 次，使可能存在的细菌凝团分散。根据样品污染程度确定稀释倍数。以无菌操作方式吸取 10 ml 充分混匀的样品，注入盛有 90 ml 无菌水（6.2）的三角烧瓶中（可放适量的玻璃珠），混匀成 110 稀释样品。吸取 110 的稀释样品 10 ml 注入盛有 90 ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成 1100 稀释样品。按同法依次稀释成 11 000、110 000 稀释样品。每个样品至少应稀释 3 个适宜浓度。注：吸取不同浓度的稀释液时，每次必须更换移液管。9.2 接种 以无菌操作方式用 1 ml 灭菌的移液管吸取充分混匀的样品或稀释样品 1 ml，注入灭菌平皿中，倾注 1520 ml 冷却到 4447的营养琼脂培养基（6.1），并立即旋摇平皿，使样品或稀释样品与培养基充分混匀。每个样品或稀释样品倾注 2 个平皿。9.3 培养 待平皿内的营养琼脂培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上（避免因表面水分凝结而影响细菌均匀生长），在 361条件下，恒温培养箱（7.3）内培养 48 h2 h 后观察结果。9.4 空白试验 用无菌水做实验室空白测定，培养后平皿上不得有菌落生长，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。10 结果计算与表示 10.1 结果判读 平皿上有较大片状菌落且超过平皿的一半时，该平皿不参加计数。片状菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均匀时，将此分布均匀的菌落计数，并乘以 2代表全皿菌落总数。HJ 10002018 4 外观（形态或颜色）相似、距离相近却不相接触的菌落，只要它们之间的距离不小于最小菌落的直径，予以计数。紧密接触而外观相异的菌落，予以计数。10.2 结果计算 以每个平皿菌落的总数或平均数（同一稀释倍数两个重复平皿的平均数）乘以稀释倍数来计算 1 ml样品中的细菌总数。各种不同情况的计算方法如下：优先选择平均菌落数在 30300 之间的平皿进行计数，当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，以该平均菌落数乘以其稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 1）。若有两个稀释倍数平均菌落数在 30300 之间，计算二者的比值（二者分别乘以其稀释倍数后，较大值与较小值之比）。若其比值小于 2，以两者的平均数为细菌总数测定值；若大于或等于 2，则以稀释倍数较小的菌落总数为细菌总数测定值（见表 1 例 2、例 3、例 4）。若所有稀释倍数的平均菌落数均大于 300，则以稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 5）。若所有稀释倍数的平均菌落数均小于 30，则以稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 6）。若所有稀释倍数的平均菌落数均不在 30300 之间，则以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 7）。表 1 稀释倍数选择及菌落总数测定值 不同稀释倍数的平均菌落数 示例 10 100 1 000 两个稀释倍数 菌落数之比 菌落总数/（CFU/ml）1 1 365 164 20 16 400 2 2 760 295 46 1.6 37 750 3 2 890 271 60 2.2 27 100 4 150 30 8 2 1 500 5 无法计数 1 650 513 513 000 6 27 11 5 270 7 无法计数 305 12 30 500 10.3 结果表示 测定结果保留至整数位，最多保留两位有效数字，当测定结果100 CFU/ml 时，以科学计数法表示；若未稀释的原液的平皿上无菌落生长，则以“未检出”或“1 CFU/ml”表示。细菌总数检验记录及报告推荐格式参见附录 A。11 精密度和准确度 11.1 精密度 6 个实验室分别对低浓度（地下水，浓度均值为 39 CFU/ml）、中浓度（地表水，浓度均值为 2.5103 CFU/ml）和高浓度（生活污水，浓度均值为 1.3105 CFU/ml）三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品（浓度为 95 MPN/ml，可接受范围为 22168 MPN/ml）进行了 6 次重复测定：实验室内相对标准偏差范围分别为 2.4%6.2%、0.6%1.8%、0.3%1.3%和 1.7%5.6%；实验室间相对标准偏差分别为 18%、4