HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群的测定 、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 10012018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和 大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 Water qualityDetermination of total coliforms，fecal coliforms and Escherichia coliEnzyme substrate method 2018-12-26 发布 2019-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 10012018 i 中华人民共和国生态环境部 公 告 2018 年 第 73 号 为贯彻中华人民共和国环境保护法，保护生态环境，保障人体健康，规范生态环境监测工作，现批准水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法等五项标准为国家环境保护标准，并予发布。标准名称、编号如下。一、水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法（HJ 347.12018）；二、水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法（HJ 347.22018）；三、水质 细菌总数的测定 平皿计数法（HJ 10002018）；四、水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法（HJ 10012018）；五、水质 丁基黄原酸的测定 液相色谱-三重四极杆串联质谱法（HJ 10022018）。以上标准自 2019 年 6 月 1 日起实施，由中国环境出版集团出版，标准内容可在生态环境部网站（ 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 3472007）废止。特此公告。生态环境部 2018 年 12 月 26 日 HJ 10012018 iii 目 次 前 言.iv 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.2 5 干扰和消除.2 6 试剂和材料.2 7 仪器和设备.3 8 样品.3 9 分析步骤.4 10 结果计算与表示.5 11 精密度和准确度.6 12 质量保证和质量控制.7 13 废物处理.7 附录 A（资料性附录）结果判定参考图片.8 附录 B（规范性附录）97 孔定量盘法 MPN 表.11 附录 C（资料性附录）97 孔定量盘法 MPN 表对应 95%置信区间.19 HJ 10012018 iv 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。本标准的附录 B 为规范性附录，附录 A 和附录 C 为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：上海市环境监测中心。本标准验证单位江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、常州市环境监测中心、上海市松江区环境监测站、上海市长宁区环境监测站和上海市青浦区环境监测站。本标准生态环境部 2018 年 12 月 26 日批准。本标准自 2019 年 6 月 1 日起实施。本标准由生态环境部解释。HJ 10012018 1 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 1 适用范围 本标准规定了测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定。本方法的检出限为 10 MPN/L。2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验用水规格和实验方法 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 494 水质 采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 总大肠菌群 total coliforms 37培养 24 h，能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。3.2 粪大肠菌群 fecal coliforms 又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms）。44.5培养 24 h，能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。3.3 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 俗称大肠杆菌。37培养 24 h，能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚，同时产生-葡萄糖醛酸酶（-Glucuronidase），分解选择性培养基中的 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放出荧光物质（4-甲基伞形酮）的肠杆菌科细菌。3.4 最大可能数 most probable number（MPN）又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释HJ 10012018 2 度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。4 方法原理 在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP）；大肠埃希氏菌同时又能产生-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解为 4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现数量，查 MPN 表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。5 干扰和消除 5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.4）消除干扰。5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5）消除干扰。6 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水应满足 GB/T 6682 中三级水的要求。6.1 培养基。本标准采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每 100 ml 样品需使用培养基粉末 2.7 g0.5 g，所含基本成分如下：硫酸铵(NH4)2SO4 0.5 g 硫酸锰（MnSO4）0.05 mg 硫酸锌（ZnSO4）0.05 mg 硫酸镁（MgSO4）10 mg 氯化钠（NaCl）1 g 氯化钙（CaCl2）5 mg 亚硫酸钠（Na2SO3）4 mg 两性霉素 B（Amphotericin B）0.1 mg 邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）50 mg 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5 mg 茄属植物萃取物（Solanium 萃取物）50 mg N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES 钠盐）0.53 g N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）0.69 g 也可采用市售商品化培养基制品。6.2 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。6.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。6.4 硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/ml。称取 15.7 g 硫代硫酸钠（6.2），溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。HJ 10012018 3 6.5 乙二胺四乙酸二钠溶液：（C10H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/ml。称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.3），溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液保质期为 30 d。6.6 97 孔定量盘：含 49 个大孔，48 个小孔。其中，每个小孔可容纳 0.186 ml 样品，大孔中 48 个大孔每个可容纳 1.86 ml 样品，一个顶部大孔可容纳 11 ml 样品。也可采用经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。6.7 标准阳性比色盘。6.8 无菌水：取适量实验用水，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。7 仪器和设备 7.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。7.2 高压蒸汽灭菌器：121可调。7.3 恒温培养箱：允许温度偏差 371、44.50.5。7.4 程控定量封口机：用于 97 孔定量盘（6.6）的封口。7.5 紫外灯：365366 nm。7.6 移液管：1 ml0.01 ml、10 ml0.1 ml。也可采用计量合格的可调式移液器。7.7 三角瓶：100 ml。7.8 量筒：100 ml1 ml。7.9 一般实验室常用仪器和设备。注：三角瓶、移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具要在试验前按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min，烘干，备用。8 样品 8.1 样品采集 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面 1015 cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.4），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5），以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml的乙二胺四乙酸二钠溶液）。注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.2）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。HJ 10012018 4 8.2 样品保存 采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于 4以下冷藏并在 2 h 内检测。9 分析步骤 9.1 样品稀释 根据样品污染程度确定接种量（见表 1），避免接种样品培养后 97 孔定量盘（6.6）出现全部阳性或全部阴性。接种量小于 100 ml 时，应稀释样品后接种，接种量为 10 ml 时，取 10 ml 样品加入盛有 90 ml无菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混匀制成 110 的稀释样品，其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品，可选用多个接种量进行检测。表 1 样品接种量参考表 接种量/ml 样品类型 102 10 1 0.1 102 水源水 湖泊（水库）地表水 河流 生活污水 处理前 废水 工业废水 处理后 地下水 9.2 接种 量取 100 ml 样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶，加入 2.7 g0.5 g 培养基（6.1）粉末，充分混匀，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盘（6.6）内，以手抚平 97 孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用程控定量封口机（7.4）封口。观察 97 孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘（6.7）的颜色，则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后，终止试验