流式细胞术基本原理及应用.ppt

流式细胞术原理及应用流式细胞术原理及应用 For FCM Training 流式细胞术 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）是一种可）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量定量 流式细胞仪系统 简介简介 通过流式细胞仪我们可以得到以下信息通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 -相对细胞大小相对细胞大小 -相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 -染色过细胞的相对荧光强度染色过细胞的相对荧光强度 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流式细胞仪的光信号 散射光信号 荧光信号 1.散射光信号散射光信号 前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号入射激光的同向散射光信号 细胞相细胞相 对大小及其表面积。对大小及其表面积。侧向角散射（侧向角散射（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）入射激光入射激光9090 角的角的散射光信号散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光 FSC Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser 侧向角散射光SSC FALS Sensor 90LS Sensor Laser 散射光 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异上的差异 -通常使用通常使用“散点图散点图”来看散射光信号来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据数据 散点图Dot Plot lysed whole blood Review Question Dead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells.Which of the populations on this plot would you expect to be dead?2.荧光信号荧光信号 荧光素吸收激光能量荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强号越强 荧光检测器 FreqFluorescence FALS Sensor Fluorescence detector(PMT3,PMT4 etc.)Two-Color Cell Analysis Which of the three populations has the most Ab A binding sites?Ab A Ab B 双色荧光散点图 现代流式细胞仪包括 液流系统液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统光学系统 激发和收集光信号 电子系统电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 液流系统 液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处 Sample Flow in Optical Cuvette Sample Laminar Flow Low Sample Flow Rate 12 mL/min Sheath Sheath Sample Laminar Flow Sheath Sheath Optical Cuvette High Sample Flow Rate 60 mL/min Review Question Which of the following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cuvette?A.bubbles B.cellular concentration C.sample flow rate Optics Excitation optics consist of:Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of:Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors Optical Filters 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 Longpass Shortpass Bandpass FACSCalibur光路图 Optics Laser Fluorochromes Detector Parameter Filter FITC GFP FL1 530/30 PE PI FL2 585/42 PerCP PerCP-CY5.5 FL3 670LP APC FL4 661/16 488 nm 635 nm Electronics Converts analog signals to proportional digital signals Computes Height for each pulse Calculates width and area Interfaces with the computer for data transfer Creation of a Voltage Pulse-Analog Signal Laser Laser Laser Time Voltage Time Voltage Time Voltage Quantification of a Voltage Pulse Time Volts Pulse Area Pulse Height Pulse Width 0 Height is a measurement for all parameters.Width=Area/Height Effect of the Instrument Controls on the Data Instrument Controls Detector FSC detector 250 gain FSC detector 350 gain Review Data Processing FL2 FL1 SSC FSC FL4 FL3 Review Questions 1.Which of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur?a.DAPI(ex.345 nm,emits 455 nm)b.Propidium Iodide(ex.536 nm,emits 617 nm)c.Alexa Fluor 647(ex.650 nm,emits 668 nm)2.What are the three measurements of a particle that can be determined by FACSCalibur?3.Briefly describe the functions of the fluidics,optics,and electronics systems.Review Questions 4.What would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls?Review Questions 5.Which instrument components ensure that the fluorescence signal of a specific fluorochrome is only measured by a designated detector?For example,APC is only measured by the FL4 detector.样本处理 细胞悬液的制备 细胞悬液：细胞悬液：分离分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差特定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小用血量小 灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系 实体组织：实体组织：病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质 步骤一：选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 荧光产生过程 Propidium Iodide 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Rel ati ve Intensi tyPI DNA Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorescein(FITC)400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Rel ati ve Intensi tyWavelength Protein Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Phycoerytherin(PE)Protein Allophycocyanin(APC)Protein 632.5 nm(HeNe)Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm FITC和和PE荧光荧光光谱光谱 补偿模型图补偿模型图 步骤二：染色 体积 温度 孵育时间 对照 直接染色 Fluorescent probe attached to antibody Specific signal:weak Nonspecific binding:low 间接染色 Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific signal:strong,5-6 2nd Ab/each 1st Ab;Nonspecific binding:high Avidin-Biotin method I biotinylated primary Ab biotin avidin biotinylated dye 示意图 步骤三：数据收集和分析 画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？仪器设置调节仪器设置调节 1.用未染色细胞调整仪器用未染色细胞调整仪器PMT电压电压 2.用单染色的细胞调节仪器补偿用单染色的细胞调节仪器补偿 关于同型对照 例：一个双色染色的实验