流式细胞术及其科研应用.ppt

流式细胞术流式细胞术 及其科研应用及其科研应用 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 BD Biosciences Immune Function 流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,Flow Cytometry,简称简称FCMFCM）是一种可是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量以定量 BD Biosciences Immune Function 流式细胞术的特点流式细胞术的特点 极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（流式细胞仪（Flow cytometerFlow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。乃至数百万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNADNA含量、抗原或受体表达量、含量、抗原或受体表达量、CaCa2+2+浓度、酶活性以及细胞的浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 强大的分选功能，在分析的强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选 BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构 细胞大小细胞大小 细胞粒度细胞粒度 细胞表面面积细胞表面面积 核浆比例核浆比例 DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期 RNARNA含量含量 蛋白质含量蛋白质含量 细胞功能细胞功能 细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异核的特异性抗原性抗原 细胞活性细胞活性 细胞内细胞因子细胞内细胞因子 酶活性酶活性 激素结合位点激素结合位点 细胞受体细胞受体 BD Biosciences Immune Function 当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势 从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析 从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析 BD Biosciences Immune Function 散射光信号散射光信号 Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC Forward Light Detector Cell Surface Area FSC Incident Light Source 前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性 Laser FALS Sensor BD Biosciences Immune Function 外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后）BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号 荧光信号荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 BD Biosciences Immune Function 荧光信号荧光信号 双色直接染色双色直接染色 BD Biosciences Immune Function 数据分析数据分析 直方图分析直方图分析 BD Biosciences Immune Function 数据分析数据分析 点图分析点图分析 BD Biosciences Immune Function 数据分析数据分析 等高图和密度图分析等高图和密度图分析 BD Biosciences Immune Function 数据分析数据分析 三维图分析三维图分析 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用 BD Biosciences Immune Function 临床研究临床研究:血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、.环境研究：环境研究：海洋生态研究.制药工业制药工业 食品工业食品工业 农业畜牧业农业畜牧业 流式细胞仪的应用领域流式细胞仪的应用领域 BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用(免疫免疫)淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 CD4CD4绝对计数绝对计数 HIVHIV的诊断与研究的诊断与研究 淋巴细胞淋巴细胞 CD4/CD8CD4/CD8分析分析 CD4CD4绝对计数绝对计数 T T细胞活化细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化检测淋巴细胞和单核细胞的活化检测 细胞因子的检测细胞因子的检测 HLAHLA-B27B27检测检测 BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用(血液血液)白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病残留白血病 造血干细胞计数造血干细胞计数 PNHPNH诊断诊断 网织红细胞分析网织红细胞分析 血小板分析血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化血小板活化 网织血小板分析网织血小板分析 BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用(肿瘤肿瘤)细胞周期分析细胞周期分析 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志标志 在在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 多药耐药基因的检测多药耐药基因的检测 BD Biosciences Immune Function 流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用 树突细胞研究树突细胞研究 干细胞研究干细胞研究 细胞凋亡细胞凋亡 细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究 环境微生物分析环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究 BD Biosciences Immune Function 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为 B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关 T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关 总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NKNK细胞（细胞（CD3CD3-CD16+56+CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能，能能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。作用。BD Biosciences Immune Function 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为 T T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHDGVHD的攻击的攻击 Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE）Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血 BD Biosciences Immune Function 常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化：疾病疾病 CD4+CD8+CD4+/CD8+类风湿性关类风湿性关节炎节炎 （活动期活动期）系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 -或或 （活动期活动期）多发性硬化症多发性硬化症 重症肌无力重症肌无力 膜型肾小球肾炎膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎乙型肝炎 自身溶血性贫血自身溶血性贫血 上呼吸道感染上呼吸道感染 BD Biosciences Immune Function 常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤肿瘤 再障及粒细胞减少症再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染 血小板减少血小板减少 活动性特应性皮炎活动性特应性皮炎 过敏性皮炎过敏性皮炎 BD Biosciences Immune Function 淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析 12%76%49%26%11%BD Biosciences Immune Function AIDS 病人病人T亚群分析亚群分析 27-51%15-44%50-84%BD Biosciences Immune Function 先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症 5-18%淋巴细胞淋巴细胞 活化功能研究活化功能研究 BD Biosciences Immune Function T淋巴细胞活化淋巴细胞活化 细胞数目增殖细胞数目增殖 细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记 分泌细胞因子分泌细胞因子 BD Biosciences Immune Function T细胞激活抗原表达的动力学曲线细胞激活抗原表达的动力学曲线 BD Biosciences Immune Function 活化的淋巴细胞分泌细胞因子活化的淋巴细胞分泌细胞因子 FastImmune Assay System 快速全面检测淋巴细胞功能快速全面检测淋巴细胞功能 BD Biosciences Immune Function BD FastImmune Act