HGPRT---、TK---杂交瘤细胞Ig---、HGPRT.ppt

分子生物学实用技术 抗 体 技 术 李 官 成 中南大学肿瘤研究所 2012-5-7 免疫学的科学早期 (19世纪中叶-1912年)血清疗法：1890年德国的贝林(Emil von Behring)和同事日本学者北里柴三郎(Kitasato)用白喉及其破伤风外毒素免疫动物，所获得动物血清可中各或破坏其毒素作用，并且可预防由毒素所导致疾病的发生。随后，被称之为抗血清。贝林贝林 E.,BehringE.,Behring 1854-1917 1901年获诺贝尔 生理学及医学奖 埃利希.P.(Paul Ehrlich,1854-1915)德国细菌学家、免疫学家 1908年获诺贝尔生理学及医学奖 最早用化学反应解释免疫过程。第一个定量地研究了毒素与抗毒素的沉淀反应，建立起抗体理论。由于他的研究，后来科学家才开始使用“免疫化学”这个名词，因此他被誉为免疫化学的先驱。埃德尔曼.G.M.(Gerald Maurice Edelman,1929-)美国生物化学家 1972年获诺贝尔生理学及医学奖 主要阐明了抗体分子结构，对生物化学和免疫学研究作出了重大贡献。1969年4月，在美国实验生理学学会联合会第53次年会上，Edelman正式宣布：自己已解决抗体分子最详尽的化学结构即其氨基酸序列问题。与会者一致认为：这项研究成果“是解决抗体分子三维结构问题至关重要的一个步骤，是一项重大成就，它必将对进一步了解抗体的功能发挥巨大的作用。波特.R.R.(Rodney Robert Portel,1917-1986)英国生物化学家 1972年获诺贝尔生理学及医学奖 首次提出抗体四肽链结构，为阐明 抗体的结构和它的特异性之间的贡 献，提供了极重要的证据。是分子免疫学的创始人之一。是Fc、Fab和重链与轻链的发现者。因开发了放射免疫分析法，1977年获得诺贝尔生理学及医学奖。发现在用胰岛素治疗糖尿病时，可使机体产生抗胰岛素的抗体。但是这一重要研究成果开始并未得到大家的承认，因为人们认为象胰岛素这样的小分子并不能刺激机体产生抗体。柏森（1972年逝世）和Yalow接着研究发现，向免疫复合物（由标记的胰岛素及其相应抗体形成）中加入过量的未标记胰岛素时可使部分的胰岛素被取代。雅洛.R.(Rosalyn Yalow,1921-2011)美国物理学家 1977年获诺贝尔生理学及医学奖 研究病毒学和免疫学的专家 是世界上研究流行性感冒、白血病和病毒性疾病的权威。提出了间接模板学说和获得性免疫的无性繁殖系选择学说，对于临床医学、免疫学及分子遗传学具有极其重要的意义。在免疫学理论上的建树是十分巨大的，他的理论假说对后继免疫学研究产生了深远而重大影响。在免疫学理论上，目前尚未见比他起到更大历史影响作用的研究者。伯内特.F.M.(Frank Macfarlane Burnet,1899-1985)澳大利亚免疫学家 1960年获诺贝尔生理学及医学奖 他与与著名生物化学家米尔斯坦共同研究开发出一套制备单克隆抗体的新技术，被誉为上世纪70年代医学和生物学领域的一个革命。他们1973年开始研究单克隆抗体。1975在英国剑桥医学研究会研究出一种新技术，可使鼠细胞与人类细胞融合，产生一种被称为“杂交瘤”的细胞。对这种杂交瘤细胞进行无性繁殖，即可产生大量抗感染的抗体。科勒.G.(Georges Kohler,1946-1996)德国免疫学家 1984年获诺贝尔生理学及医学奖 1975年他们将适应于组织培养的小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合，获得了能分泌与免疫原起反应的抗体的杂交瘤细胞株。这种杂交瘤细胞株既有骨髓瘤细胞的永生性（能在组织培养中大量增殖），又能分泌大量的单克隆抗体。米尔斯坦.C.(Cesar Milstein,1927-)生物化学家（英国和阿根廷双重国籍）1984年获诺贝尔生理学及医学奖 是现代免疫学之父，为现代免疫学的 建立奠定了基础。提出了三个学说：抗体形成的“天然”选择学说；有关抗体多样性发生的学说；免疫系统的网络学说。杰尼.N.K.(Niels K.Jerne,1911-)丹麦免疫学家 1984年获诺贝尔生理学及医学奖 一、抗体相关理论一、抗体相关理论 抗体（抗体（antibody,Abantibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。（一）抗体的发现（一）抗体的发现 早在19世纪后期，Behring和Kitasato就发现用白喉或破伤风毒素免疫动物后产生一种可以中和毒素的物质，称之为抗毒素（antitoxin）。后引入“抗体”一词泛指抗毒素类物质。1939年Tiselius和Kabati证实抗体为球蛋白。1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会的专门委员会先后决定：将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig,SIg）膜型（membrane Ig,mIg）两种。Sig存在于备注及组织洲中，具有抗体的各种免疫功能；mIg是B细胞表面的抗原受休。抗体生成理论 1897年 侧链学说 1930年 模板学说 1941年 间接模板学说 1955年 自然选择学说 1958年 克隆选择学说 （二）抗体的结构（二）抗体的结构(1)重链（heavy chain，H）2条 轻链（light chain，L）2条(2)可变区（variable region,V区）恒定区（constant region,C区）(3)超变区（hyper-variable region,HVR),又称互补决定区(complementary determining region,CDR）骨架区（framework region,FR）(4)铰链区（hinge region）可变区恒定区（Variable and constant regions）Hypervariable region,HVR(1,2,3)(高可变区)Framement region,FR(1,2,3,4)(骨架区)Complementarity determining region,CFR(1,2,3)(互补决定区)Antigen-binding site(抗原结合部位)（三）抗体的功能区（三）抗体的功能区 Ig的多肽链分子可折叠成几个由链内二硫键连接的球形结构，每个球形结构由约110个氨基酸残基组成，并代表一个功能区。（四）抗原抗体结合的基础（四）抗原抗体结合的基础 抗体对抗原的结合是一种典型的特异性免疫结合，抗体结合抗原的部位位于Fab片段可变区结构域中的CDR区。（五）抗体基因的遗传控制（五）抗体基因的遗传控制 完整的抗体分子由轻链（包括和）基因和重链基因 编码。编码一条免疫球蛋白多肽链的基因是由胚系中分隔开的 基因片段经重排而形成的。即免疫球蛋白的可变区和恒 定区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞的发育过 程中，这两个基因因为发生易位而重排在一起形成编码 完整免疫球蛋白分子的基因。免疫球蛋白基因的染色体定位 人 鼠 重 链 14q32 12F1 kappa 链 2p12 6c2 lambda链 22q11 16 重链可变区基因的重排 链基因的重排 链基因的重排 （六）抗体多样性机制（六）抗体多样性机制（1）编码Ig基因的多样性（2）体细胞突变（3）V、D、J基因连接的多样性（4）H链和L链相互随机配对 二、抗体技术二、抗体技术 抗体的产生有三种条途径：经典途径：即免疫动物产生多克隆抗体（抗 血清）；细胞工程途径：即运用杂交瘤技术产生单克 隆抗体；利用基因工程途径表达和改造抗体。抗体种类：第一代抗体：多克隆抗体 polyclonal antibody 第二代抗体：单克隆抗体 monoclonal antibody 第三代抗体：基因工程抗体 genetic engineering antibody（一）B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体 克隆：细胞集落 单克隆：一个无性繁殖细胞集落 单克隆抗体：一个B细胞无性繁殖所产生的抗体 特点：一种抗体，性质、结构均一 杂交瘤：淋巴细胞+骨髓瘤细胞=融合=杂交瘤细胞 特点：继承淋巴细胞产生抗体 继承瘤细胞在体外长期培养 1.免疫原和免疫程序 (1)颗粒性抗原：细胞、微生物等 表面抗原一般有较高的免疫原性，不加佐剂。如细胞抗原一般以1-2 107 细胞腹腔注射。(2)可溶性抗原：蛋白质类 一次剂量为10-100ug，需加佐剂。(3)弱抗原：多肽、糖类、类固醇等 与蛋白交联，如白蛋白、KLH等(4)微量抗原：常采用特殊的免疫方法 体外免疫 10-100ng/ml 脾内一次注射 20ug(蛋白抗原)，2.5 105(细胞)程序：常规 0、21、42天免疫，52天试血，融合前3天加强免疫 快速 0、14、28天免疫，38天试血，融合前3天加强免疫 McAb and PcAb McAb与PcAb的比较 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 稳定性 低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 2.培基的配制 基础培基：DMEM RPMI1640 选择性培基：HAT培基 谷氨酰胺、丙酮酸钠 血清：小牛血清（需筛选）完全培基 3.融合用细胞（1）骨髓瘤细胞 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同 种类：小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 无Ig 缺乏HGPRT NS-1 k 缺乏HGPRT 大鼠骨髓瘤细胞 Y3-Ag1.2.3 抗体得量较高 人骨髓瘤细胞 SK007 培养技术较困难 培养 选择对数生长期的细胞进行传代和融合 细胞106/ml 细胞老化 避免返祖：返祖即重新获得HGPRT 细胞用15-20ug/ml 8-氮鸟嘌呤处理 不要过多传代 （2）免疫脾细胞 目的 取得分裂活跃并能产生特异性抗体的B细胞，增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤频率。来源 A.小鼠脾脏：Balb/c 8-12周龄 B.大鼠脾脏：C.人：外周血淋巴细胞、淋巴结、扁桃体（3）饲养细胞 定义 能够支持其它细胞生长的细胞。来源 A.小鼠的腹腔细胞 B.大鼠的胸腺细胞 作用 A.产生非种属特异性生长因子 B.吞噬坏死细胞 4.细胞融合(1)方法 A.PEG法 B.自发触发 C.仙台病毒 D.受体指引法 E.电融合法 F.激光法 G.磁场融合 (2)整个过程 A.饲养细胞的制备(融合前一天)小鼠 消毒固定 暴露腹膜 注入Hanks 按摩 抽出 无血清培基洗一次 计数(2105/ml)B.骨髓瘤细胞 复苏(前7天)扩增 收集细胞(对数生长期)计数及活力测定(活率 95%，总数 10 7)C.免疫脾细胞的制备 加强免疫后3-4天 免疫鼠 眼框放血 血清供检测用 处死消毒，无菌取出脾脏 制备单细胞悬液 50ml离心管静止5-10分钟 吸上清于另一50ml离心管，1000rpm，10分钟 计数，活力测定。D.PEG 作用机理：使细胞膜脂类分子在结构上发生重排，细胞膜容易被打开，最终引起细胞融合。作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同 MW：600，1000，1500，4000，6000 MW 融合率 细胞毒性 配制：PEG，8磅15分钟；50 时加等量无血清培基(50%,W/V)。30%融合率低 50%毒性 E.细胞融合 a.试剂、培基，37水浴。b.脾细胞、骨髓瘤细胞混合，1-10：1。c.1000rpm，10分钟。d.轻弹离心管底部，使两种细胞充分混匀成糊状。e.加50%PEG 0.5ml(在37水浴中、边加边轻弹、1分钟内加完）。f.静置90秒(37水浴)。g.滴加15ml无血清DMEM(37预热)，2分钟内加完。h.1000rpm，10分钟，弃上清。i.加完全培基或HAT培基，调整细胞浓度5 105/ml。j.加入含饲养细胞的细胞板，每孔0.1ml。5.选择性培养(1)目的 脾细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 (2)原理 HGPRT酶与TK酶：次