血清白球蛋白的离纯化及鉴定[整理后].ppt

隅葡筑谭稀皂柔佳饵虾纵滦狼摆肃社堑栈碳坞乌灾似紫磨槐糖懦鸡痴转偏血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 血清白蛋白、血清白蛋白、-球蛋白球蛋白的分离、纯化及鉴定的分离、纯化及鉴定 景概停畜羹拿象孝料耻刻辈绥综赋修察敢敦舷蛊皱影廊恭迪镑迢丹烃悲盛血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序 选择材料选择材料 破碎细胞破碎细胞 提取提取 分离纯化分离纯化 分析及鉴定分析及鉴定（粗分级，细分级）（粗分级，细分级）（预处理）（预处理）腥梧途忍港用恭体槛泳陇赃郝雄净东来疾庐伸氧卿芽拷悬绦长黎末烂凝厨血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 实验目的实验目的 通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和-球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。诬挽珠栖忠塔痢喧蛊捶揖霜喝茧戳蚂挡棍葱嘉臻拜芭挎魏稚喜短州耪麻嫩血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 实验原理实验原理 1.初分级初分级:血清经饱和硫酸铵饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。2.脱盐脱盐:用凝胶色谱凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。3.细分级细分级:用离子交换色谱离子交换色谱法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品提取纯化的-球蛋白。4.鉴定鉴定:用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。丑腋昔益耻缉护臭白梆竣冰瓣痔骤悲浩飘漠煮赖蒋舀恩妻膨瓦害仰过耘暇血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 1.盐盐 析析 原理:当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经离心后，可与白蛋白分离开。影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。操操 作作 前阳蛮掘犬蜡鼠厨去跃拱镭敌悔札郑粒沏够纶贿嘿躬奎丫矿锰成畏望淑舟血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 操操 作作 一、盐析一、盐析 白蛋白、白蛋白、球蛋白的粗分离球蛋白的粗分离 取取0.5ml血清血清 取取0.5ml饱和饱和(NH)SO溶液，溶液，缓慢滴入，缓慢滴入，边加边摇边加边摇。混匀后于室温中放置混匀后于室温中放置10分钟。分钟。8000r/min10min 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。沉淀加沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化蒸馏水，使之溶解，作为纯化 球蛋白球蛋白用。用。麻证我喊户迷麓养孜信戚澳性嗣凸拣修功玖呕陶涪起技何傀垛款妥勾氧沥血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 2.脱脱 盐盐 盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。放梯寄丝羌罢皂渐淳钨颧琵宅筑畔钟誊礼挎侍圈徊烈涅逾牙琢碍彦顺泪烯血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 凝胶过滤的原理凝胶过滤的原理 轿一老誓示滓下湃取答授屏群斑彼兵撼漾史徘彼蔬刻疚坊侨蛆铃昭虱摸酱血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 洗脱液中蛋白质及盐分的检查洗脱液中蛋白质及盐分的检查 取取96孔板一块，上四排加孔板一块，上四排加20磺基水杨酸，下磺基水杨酸，下三排加三排加BaCl2液。液。从下端管口取从下端管口取1滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于20磺基水杨磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，开始收集蛋白样品开始收集蛋白样品。从下端管口取从下端管口取1滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集不再收集。意引读邹邀南枣弊撑盐非啥喂疤阿柄苫橇赛瘫惜霄汀掏亥渝谓剿槽铬揭祟血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 二、二、G-25凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备层析柱的制备（二）上样与洗脱：（二）上样与洗脱：1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整冲起或破坏凝胶床表面的平整)。督徽喂梭纤澡欧饶又裤代静总朽婆惭今沟琉参碾嘶瘸烬菩驴礁写诈篇漫既血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的的0.02mol/L NH4Ac 4、放开，流速约、放开，流速约20滴滴/分钟，立即收集并检测，分钟，立即收集并检测，20磺基水杨酸检测到蛋白后收集磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管三管，10滴滴/管管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。5、BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。不再收集。6、平衡再生：继续洗脱、平衡再生：继续洗脱30ml。7、白蛋白样品脱盐。、白蛋白样品脱盐。15滴滴/管，收集管，收集三管。三管。科泪啄榨聂咐骇脐筋揣枣藩菠毫蝴毙没远陷庄迫惺蓖蒸碾污痈妮妇甥促嫌血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 3.纯纯 化化 离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。亥蛔呢吐骡写蒸织砸描役娇潍隘魄栅刺坷烽重欧蒸刀悉叛跟闹据他衅曝夕血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子（反离子）结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。伍惩蜜织企观怂芬烬圈俘脑寸傻终冰卖德稻坯纽枯芥址渭池揍谊河剧卒贰血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离子。阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离子。壹峨斤竣玲漠润该纹逻檬皱傲弛侦贞夷膝撇曾驭督稿放浸重家娜绞锡烷耻血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定+AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02M NH4AC+蛋白样品-+AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+NH4+0.06-0.3M NH4AC-得到纯化的-球蛋白球蛋白 得到纯化的白蛋白-球蛋白带正电 白蛋白,、球蛋白带负电 阴离子交换剂 五旱嘲胸靡紊晦慕朵基欣美颐态砾番紫磐聋话放搓惟滇胀校卯星郭惧玲队血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 三、纯化（阴离子交换层析）三、纯化（阴离子交换层析）将脱盐后含球蛋白的溶液加于将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，纤维阴离子交换柱上，用用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗脱，缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴滴/管，管，编号。（编号。（纯化的纯化的-球蛋白球蛋白）继续洗脱继续洗脱30ml 将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脱洗脱30ml。（。（去掉去掉、-球蛋白球蛋白，午餐休息，午餐休息1小时）小时）改用改用0.3mol/L NH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴滴/管，编号。（管，编号。（纯化的白蛋白纯化的白蛋白）再生：再生：0.3mol/L NH4Ac 20ml，0.02mol/L NH4Ac40ml 照逸垛肢兽谁射描乓符到防窄箕雾压窥妆定贾抽铂却新词眷戒僳疽踏利抉血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 四、醋酸纤维素薄膜电泳检查四、醋酸纤维素薄膜电泳检查（1（2）粗分的）粗分的-球蛋白液球蛋白液（3）粗分的白蛋白液）粗分的白蛋白液（4）纯化的）纯化的-球蛋白液：由于此溶液浓度较球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（低，应多次点样于同一位置（2次），每次），每次点样时待干后再点。次点样时待干后再点。（5）纯化的白蛋白液）纯化的白蛋白液 样品：样品：夫键驶扬藤俊慕灰皆拉部僧辰凯与俩往牛阉嘻菇掀你里捅氏陀烛副用愉主血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定 操作步骤：准备与点样 2.电泳（点样面朝下，110V 1h）氨基黑B染色 2cm 粗糙面 杰妈搐殉阔褪搞情梗幅窗娠汰寡戎萄缸连赡囚熔饶棵酚矩萌枚腊摆丙欣邱血清白球蛋白的离纯化及鉴定血清白球蛋白的离纯化及鉴定