血红蛋白的提取和分离(优质课).ppt

血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。基础知识基础知识 3 3、提取分离方法、提取分离方法 凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 基础知识基础知识 2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或 琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，的大小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行作用，来进行分离。分离。1.概念：（一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）基础知识基础知识（一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢道，路程较长，移动速度较慢;而相对而相对分子量分子量较大较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部凝胶外部移动，路程移动，路程较短较短，移动速度，移动速度较快较快。相对相对分子质量不同分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。的蛋白质分子因此得以分离。依依据的特性是：据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量外加少量强酸或强碱强酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不不变的混合溶液。变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影值的影响，维持响，维持PHPH基本不变基本不变。2.2.作用作用:基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 基础知识基础知识 3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_,其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证血环境，保证血红蛋白的红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能，便于观察，便于观察(红色红色)和和科学研究科学研究(活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些下，这些基团会带上正电或负电。基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。移动。电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带带电性质电性质的差异以及的差异以及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不的不同，使带电分子产生不同的同，使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实，从而实现样品中各种分子的分离现样品中各种分子的分离。基础知识基础知识 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定 运动方向运动方向 形成形成 库仑力库仑力 形成形成 阻力阻力 决定决定 运动速率运动速率 电荷性质电荷性质 电荷量电荷量 分子形状分子形状 分子大小分子大小 3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在在电场电场的作用下，的作用下，这这些些带电带电分子分子会会向着向着与与其所其所带带电电荷相反的荷相反的电极电极移移动动 琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、测定蛋白质分子量、测定蛋白质分子量:常用常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取于取于它所带它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。2.2.原理：原理：SDSSDS能使能使蛋白质发生完全变性。解聚成单蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链条肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单条肽链的分单条肽链的分子量子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而。因而掩盖了不同种蛋掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，白质间的电荷差别，使使电泳迁移率完全取决电泳迁移率完全取决于分子的大小于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。售。电泳检测结果电泳检测结果 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 实验操作实验操作 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 1.1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程（二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。血液来分离血红蛋白。血血液液 血浆血浆 水水 分分 固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细胞血细胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多）血红蛋白血红蛋白 （9090）两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁血红素基团四个亚铁血红素基团 2.提问：提问：血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.提问：提问：用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、羊的，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白 两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子一分子O2或一分子或一分子CO2，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.1 1、采集血样、采集血样 2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细（速度越高和时间越长，会使白细 胞等一同沉淀，达不到分离的效果）胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞下层暗红色的红细胞+五倍体积的五倍体积的0.90.9 的的NaClNaCl溶液洗涤，搅拌溶液洗涤，搅拌10min10min 5 5、低速、低速短时间短时间离心：离心：6 6、重复、重复3 3、4 4、5 5步骤三次步骤三次 上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。目的目的:操作：操作：洗涤次数过少洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。无法除去血浆蛋白。(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，加加40体积的甲苯体积的甲苯（溶解细胞膜）（溶解细胞膜）置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌搅拌10min（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋白红细胞破裂，释放出血红蛋白(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速的速度度离心离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层甲苯层（无色透明）；（无色透明）；第第2层（中上层）：层（中上层）：脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；（白色薄层固体）；第第3层（中下层）：层（中下层）：血红蛋白的水溶液层血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；（红色透明液体）；第第4层（最下层）：层（最下层）：杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色）。（暗红色）。分离分离：滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，分液漏斗中静置：分出下层的分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液红色透明液体体。甲苯层甲苯层（无色透明）无色透明）白色薄层固体白色薄层固体 红色透明液体红色透明液体 杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次 (4)(4)透透 析：析：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液的血红蛋白溶液装装入透析袋中，将透析袋入透析袋中，将透析袋放入盛有放入盛有300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析12h12h 目的：目的：除去样品中分子量较小的杂质和离子。除去样品中分子量较小的杂质和离子。或用于更换样品的缓冲液。或用于更换样品的缓冲液。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 1mL 透析过程动画演示透析过程动画演示 利用透析袋透析利用透析袋透析 2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端磨平。两端磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安