血清LDH同工酶测定.ppt

血清血清LDH同工酶测定及图谱分析同工酶测定及图谱分析 南昌大学医学院南昌大学医学院 关于同工酶关于同工酶 1957年Markert等人用电泳的方法将纯 化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区 带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化 活性，从而首先在1959年提出了同工酶的 概念。南昌大学医学院南昌大学医学院 同工酶同工酶:来源于同一个体或组织，能来源于同一个体或组织，能催化相同的化学反应，但其蛋白催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组能等方面都存在明显差异的一组酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（酶（LDHLDH）同工酶。）同工酶。南昌大学医学院南昌大学医学院 为什么要进行血清为什么要进行血清 LDH同工酶测定？同工酶测定？南昌大学医学院南昌大学医学院 南昌大学医学院南昌大学医学院 生物学中的应用：可用于研究物种进化、遗 传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗只有一种LDH肽链 ，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链；LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物 各组织中LDH同工酶各组分含量不同，具有明显 的物种间差异可作为动物分类的生化依据。同工酶的应用同工酶的应用 文献：鲿科四种鱼LDH同工酶谱的研究 【摘要】：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对鲿科四种 鱼血清中LDH同工酶进行电泳分析,结果表明:四种鱼 血清LDH同工酶图谱的区带分布具有种的特异性;四 种鱼血清LDH同工酶A、B亚基比例关系反映的各品种 间亲缘的关系与形态学特征分析结果吻合,为鲿科四 种鱼分类提供进一步的理论依据.南昌大学医学院南昌大学医学院 同工酶的应用同工酶的应用 是否人种间在差异呢？这个答案不 得而知，但有一点是明确的，那就是LDH同 工酶在人体不同器官和组织间是有差异的，从医学角度来讲，利用这种特异性临床上对 LDH同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据 之一。南昌大学医学院南昌大学医学院 同工酶的应用同工酶的应用 南昌大学医学院南昌大学医学院 在临床检验方面，通过观测病人血清中LDH同 工酶的电泳图谱，辅助诊断哪些器官组织发生病变 ，远较单纯测定血清LDH总活性的方法敏感。例 如，心肌受损病人血清LDH1含量上升，肝细胞受 损者血清LDH5含量增高。同工酶的应用同工酶的应用 一、LD同工酶的形式 南昌大学医学院南昌大学医学院 H（heart）、M（muscle）南昌大学医学院南昌大学医学院 二、LD同工酶的分布 南昌大学医学院南昌大学医学院 组织中的比例不同，心肌中以LDH1及LDH2较为丰 富，骨骼肌及肝中含LDH5及LDH4较多。这都与它们的 生理功能关。LDH1和LDH2对乳酸亲和力高，易使乳酸 脱氢氧化生成丙酮酸，后者进一步氧化可释放出能量供 心肌活动的需要；LDH5与LDH4对丙酮酸的亲和力高，而使它得氢还原成乳酸，这对保证肌肉在短暂缺氧时仍 可获得能量有关。乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶-琼脂糖：直链多糖，半乳糖和琼脂糖：直链多糖，半乳糖和3,63,6-脱水脱水-L L-半乳糖的残基交替排列组成，主要通过氢键形半乳糖的残基交替排列组成，主要通过氢键形 成凝胶。成凝胶。凝胶电泳凝胶电泳其优点如下：其优点如下：操作简单，电泳速度快操作简单，电泳速度快 凝胶结构均匀，含水量大，对蛋白质吸附极凝胶结构均匀，含水量大，对蛋白质吸附极 少，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。少，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。电泳区带易染色，可透明直接扫描、可长期电泳区带易染色，可透明直接扫描、可长期 保存等优点。保存等优点。南昌大学医学院南昌大学医学院 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1、琼脂糖凝胶电泳法原理、琼脂糖凝胶电泳法原理 根据根据LD同工酶一级结构和等电点的差异，同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使在一定电泳条件下，使LD在支持物上被分离。在支持物上被分离。利用酶促反应进行显色，显色深浅与酶活性成利用酶促反应进行显色，显色深浅与酶活性成 正比，利用光密度扫描仪可求出各同工酶的相正比，利用光密度扫描仪可求出各同工酶的相 对含量对含量 南昌大学医学院南昌大学医学院 柱层析法柱层析法 免疫化学法免疫化学法 热稳定性和抑制法热稳定性和抑制法 *电泳法电泳法：醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 三、测定方法 南昌大学医学院南昌大学医学院 LDH 在电泳中的分离因素 电荷因素电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 电荷因素 分子大小 分子形状 南昌大学医学院南昌大学医学院 以乳酸钠为底物以乳酸钠为底物,LDH 催化乳酸脱氢生成丙酮催化乳酸脱氢生成丙酮酸酸,同时使氧化型辅酶同时使氧化型辅酶INAD+还原为还原为NADH,NADH又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS),PMS再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝(NBT),使其还原为紫蓝色化合物使其还原为紫蓝色化合物,因此有因此有LDH 活活性的区带即着紫蓝色且颜色深浅与性的区带即着紫蓝色且颜色深浅与LDH活性成正活性成正比比.1、LDH同工酶琼脂糖凝胶电泳显色原理同工酶琼脂糖凝胶电泳显色原理 南昌大学医学院南昌大学医学院 缓冲液条：内含缓冲液条：内含pHpH 8 8.4 4、离子强度离子强度0 0.075075的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液 缓冲琼脂糖凝胶板：内含缓冲琼脂糖凝胶板：内含0 0.0808mol/Lmol/L，pHpH 8 8.3 3巴比妥巴比妥-盐酸缓冲液盐酸缓冲液EDTAEDTA-NaNa2 2溶液溶液（1010mmol/Lmmol/L），5 5g/Lg/L琼脂糖琼脂糖 底物显色液底物显色液（临用前配制临用前配制）固定漂洗液固定漂洗液 2、试剂、试剂 南昌大学医学院南昌大学医学院 打开仪器打开仪器，选择电泳程序选择电泳程序 点样点样、保湿保湿，放电极架放电极架、挂缓冲条挂缓冲条、放凝胶板放凝胶板 放点样梳放点样梳、电泳电泳，配显色液配显色液 加加显色液显色液 吸掉显色液吸掉显色液、加加固定液固定液 吸掉固定液吸掉固定液、放厚滤纸放厚滤纸 烘干烘干 胶片扫描胶片扫描 3、操作、操作 南昌大学医学院南昌大学医学院 4 4、计算、计算 A A总总（吸光度总和吸光度总和）=A A1 1 +A A2 2 +A A3 3 +A A4 4 +A A5 5 （A A1 1-A A5 5 相应为相应为LDLD同工酶同工酶LDLD1 1-LDLD5 5的吸光度的吸光度。）LDLD同工酶的百分比同工酶的百分比（%）为：为：LDLD1 1 =A A 1 1/A A总总 100100%LDLD2 2 =A A 2 2/A A总总 100100%LDLD3 3 =A A 3 3/A A总总 100100%LDLD4 4 =A A 4 4/A A总总 100100%LDLD5 5 =A A5 5 /A A总总 100100%南昌大学医学院南昌大学医学院 5、注意事项 不宜用溶血标本。不宜用溶血标本。严格控制温度（严格控制温度（LDLD4 4和和LDLD5 5，特别是，特别是LDLD5 5对热敏感，对热敏感，如底物显色液温度超过如底物显色液温度超过5050，LDLD5 5易失活）。易失活）。底物显色液需避光保存，因底物显色液需避光保存，因PMSPMS对光敏感，否则显对光敏感，否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。LDLD同工酶对冷的敏感性不同，尤其是同工酶对冷的敏感性不同，尤其是LD5LD5对冷不稳对冷不稳定。因此血清标本应该放室温保存定。因此血清标本应该放室温保存 南昌大学医学院南昌大学医学院 6、图谱分析-1 南昌大学医学院南昌大学医学院 6、图谱分析-1 南昌大学医学院南昌大学医学院 正常：LDH2LDH1LDH3LDH4LDH5 参考值(琼脂糖电泳法)：LDH1（28.45.3）%；LDH2（41.05.0）%；LDH3（19.04.0）%；LDH4（6.63.5）%；LDH5（4.63.0）%。6、图谱分析-1 南昌大学医学院南昌大学医学院 文献：儿童血清LDH及同工酶分析J.实用临床医学,2008,9(11):79-80.儿童组与成人组LDH及LDH同工酶(醋纤电泳法)结果比较 注：与成人组比较，pLDH2 文献：LDH同工酶分析在心脏病诊疗中的探讨.不同心脏病患者LDH1与2结果比较 8例心脏病患者手术后LDH1不同时间吸光度的变化 10分钟 11.5 2小时 26.56 20分钟 12.8 6小时 28.56 40分钟 14.1 12小时 26.75 60分钟 18.1 24小时 23.1 注：与心肌梗塞组比较，pLDH2，也有少数 病例表现为LDH1、5区带同时升高，这类病人除心肌梗塞外还伴有充血性心力衰 竭，由予缺氧，缺血，使肝细胞通透性增高，向血中释放大量LDH5所致。该病例特殊表现为LDH5区带高二度增加(LDH5占68)，而其它LDH1周工酶 成分相应大幅度下降，尤以LDH1减少更为著占4，实验结果表明：当心肌梗塞 病人以“M”亚基为主体时患者很快死亡。6、图谱分析-2 南昌大学医学院南昌大学医学院 LDH1/LDH2比值1还见于溶血性贫血、恶性贫血、镰形细胞性 贫血、肾脏损伤、肾皮质梗塞(皮质以LDH1和LDH2含量较高)等 脑干含LDH1较高。颅脑损伤仅累及大脑半球时，只有血清同工 酶谱的绝对值增高，而不影响同工酶的相互比值，如果累及脑 干时，病人血清LDH1的含量也增高。胚胎细胞瘤病人的血清LDH1活性升高。6、图谱分析-3 南昌大学医学院南昌大学医学院 6、图谱分析-3 南昌大学医学院南昌大学医学院 肝细胞损伤或坏死后，向血流释入大量的LDH4和LDH5，致使血中 LDH5/LDH4比值升高，故LDH5/LDH41可做为肝细胞损伤的指标。急性肝 炎以LDH5明显升高，LDH4不增，LDH5/LDH41为特征；若血清LDH5持续 升高或下降后再度升高，则可认为是慢性肝炎；肝昏迷病人的血清LDH5、LDH4活性极高时，常示预后不良；原发性肝癌以血清LDH4LDH5较为常见 ，阻塞性黄疸时LDH4 与LDH5 均增高，但以LDH4 尤为明显。6、图谱分析-3 南昌大学医学院南昌大学医学院 文献：血清乳酸脱氢酶同工酶在肝脏疾病中的检测及意义 摘要:目的 探讨血清乳酸脱氢酶同工酶检测在肝脏疾病中的临床意义。方法 LDH 同工酶测定采用琼脂糖电泳法，统计学处理采用t检验。结果 LDH1在急性肝炎 和亚急性重型肝炎中显著低于正常下限(P0.001)，LDH2在急性肝炎、慢性肝炎 、慢性肝炎、亚急性重型肝炎和肝硬化中明显低于正常值(P001)，LDH3在急性 肝炎、慢性肝炎、亚急性重型肝炎、慢性重型肝炎和肝硬化的患者中显著低于正 常下限(P0001)，LDH4在慢性肝炎、慢性重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞 癌的患者中也明显低于正常水平(P00l或P0001)，LDH5在急性肝炎、慢性 肝炎、亚急性重型肝炎、慢性重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的患者中均有 显著上升(P001或P0001)。结论 在肝炎患者血清检测中，LDH同工酶的 测定特异性较好,有助于对急慢性肝炎和肝细胞损害的诊断。6、图谱分析-3 南昌大学医学院南昌大学医学院 LDH5：骨骼肌损伤(杜氏肌营养不良、横纹肌融解症、肌肉外伤)煤矿、钨矿矽肺病人的血清LDH1、LDH2下降，LDH4、LDH5升高 肾髓质以LDH4和