血红蛋白的提取和分离(上课用)介绍.ppt

本课题学习目标本课题学习目标 简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。本原理。1 1、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳电泳法分离样品的原理法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理 3 3、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 4 4、课题难点：、课题难点：样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。和色谱柱的装填。1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。基础知识基础知识 基础知识（一）基础知识（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或琼葡聚糖或琼脂糖脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用的大小，利用具有具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行分离。作用，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理 分子量分子量 大大 小小 直径大小直径大小 大于凝胶颗粒空大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面 小于凝胶颗粒空小于凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部 运动方式运动方式 垂直向下移动垂直向下移动 垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部 运动速度运动速度 较快较快 较慢较慢 运动路径运动路径 较短较短 较长较长 洗脱次序洗脱次序 先从凝胶柱洗脱先从凝胶柱洗脱出来出来 后从凝胶柱洗脱后从凝胶柱洗脱出来出来 一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 4.4.具体过程具体过程 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质 A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快 D （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸外加少量强酸或强碱或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混 合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变。2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_,其目的是其目的是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的血红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能，便于观察，便于观察(红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性)思考：说出人体血液中缓冲液思考：说出人体血液中缓冲液 NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性带电性质质的差异以及的差异以及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不同，的不同，使带电分子产生不同的使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实现样，从而实现样品中各种分子的分离品中各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳 SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离）粗分离：透析除去分子较小的杂质。：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。质蛋白质除去。（4）纯度鉴定）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二、实验操作二、实验操作 样品处理样品处理 粗粗 分分 离离 纯纯 化化 纯度鉴定纯度鉴定 血液组成血液组成成分成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白 二、实验操作二、实验操作 血血液液 血浆血浆 水水 分分 其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细血细 胞胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多）血红蛋白血红蛋白 （9090）两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 2.血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用哺乳动物的红细胞提取，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白 知识回顾知识回顾 血红蛋白血红蛋白 两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二 氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而 呈呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：返回返回 二、实验操作二、实验操作 1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 阅读思考：洗涤的目的是什么？（阅读思考：洗涤的目的是什么？（P69：操作提示：操作提示）洗涤过程：洗涤过程：血液血液 100mL100mL 低速离心低速离心 2 min2 min 红细胞红细胞 血血 浆浆 红细胞红细胞 搅拌搅拌10min 重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色 3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠 吸出血浆吸出血浆 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 返回返回 2 2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放 二、实验操作二、实验操作 阅读思考：阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂 磁力搅拌器 返回返回 3 3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液 过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的的速度离心速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（白色薄层固体白色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。红细胞红细胞 混合液混合液 高速离心高速离心 10min 滤纸滤纸 过过滤滤 烧杯烧杯 离心离心管管 分离过程分离过程 甲苯层甲苯层（无色透明无色透明）白色薄层固体白色薄层固体 红色透明液体红色透明液体 杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次 返回返回 记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：层顺序自上而下是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀 4 4、透析、透析 过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目透析目的：的：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。二、实验操作二、实验操作 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。在袋内。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 1mL 1mL 透析过程动画演示透析过程动画演示 利用透析袋透析 返回返回 纯化凝胶色谱操作纯化凝胶色谱操作 1.1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作 2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填 教材图教材图519 3.3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 二、实验操作二、实验操作 凝胶色谱操作凝胶色谱操作:1 1、凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的制作 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意注意事项事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装