食品中肠杆菌科的检[1]...ppt

郑秋月郑秋月 辽宁出入境检验检疫局辽宁出入境检验检疫局 进出口食品中肠杆菌科检验方法进出口食品中肠杆菌科检验方法 Petrifilm测试片法测试片法 什么是肠杆菌科？什么是肠杆菌科？据细菌学新的分类，肠杆菌科现己包括肠道病据细菌学新的分类，肠杆菌科现己包括肠道病原性和非病原性的艾希氏、志贺氏、爱德华氏、原性和非病原性的艾希氏、志贺氏、爱德华氏、沙门氏、亚利桑那、枸橼酸杆菌、克雷伯氏、沙门氏、亚利桑那、枸橼酸杆菌、克雷伯氏、肠杆菌、团聚肠杆菌、哈夫尼亚、沙雷氏、变肠杆菌、团聚肠杆菌、哈夫尼亚、沙雷氏、变形杆菌、耶尔森氏、欧文形杆菌、耶尔森氏、欧文14个菌属及其他个菌属及其他9个个菌群的细菌。故以其作为指标菌则较大肠菌群菌群的细菌。故以其作为指标菌则较大肠菌群等指标菌更敏感，更准确。等指标菌更敏感，更准确。革兰氏阴性革兰氏阴性 无芽孢杆菌无芽孢杆菌 氧化酶阴性氧化酶阴性 发酵葡萄糖产酸或产酸产气发酵葡萄糖产酸或产酸产气 习惯生长于肠道、土壤、水和蔬菜习惯生长于肠道、土壤、水和蔬菜 在干燥环境中存活性差在干燥环境中存活性差 对热敏感对热敏感 部分对人体有致病性部分对人体有致病性 好氧或兼性厌氧发酵型好氧或兼性厌氧发酵型G-杆菌杆菌 氧化酶阴性氧化酶阴性 氧化酶阳性氧化酶阳性 肠杆菌科肠杆菌科 乳糖发酵乳糖发酵 非乳糖发酵非乳糖发酵 埃希氏菌埃希氏菌 克雷伯氏菌克雷伯氏菌 柠檬酸杆菌等柠檬酸杆菌等 沙门氏菌沙门氏菌 志贺氏杆菌志贺氏杆菌 耶尔森氏菌，普罗威登斯菌等耶尔森氏菌，普罗威登斯菌等 从四种食品中共分离出肠杆菌科中九个菌属的十五从四种食品中共分离出肠杆菌科中九个菌属的十五种细菌。除脱脂淡奶粉外，从其它三种食品中均分种细菌。除脱脂淡奶粉外，从其它三种食品中均分离出了阴沟肠杆菌；在速冻方便食品中，克雷伯氏离出了阴沟肠杆菌；在速冻方便食品中，克雷伯氏菌为优势菌；在脱水白罗卜和脱脂淡奶粉中均检出菌为优势菌；在脱水白罗卜和脱脂淡奶粉中均检出了团聚肠杆菌；而在冻鱼片中，检出的肠杆菌科属了团聚肠杆菌；而在冻鱼片中，检出的肠杆菌科属比较多，表明其污染源较为复杂。特别值得注意的比较多，表明其污染源较为复杂。特别值得注意的是在冻鱼片中还检出沙雷氏菌；在冻菜卷中还检出是在冻鱼片中还检出沙雷氏菌；在冻菜卷中还检出了志贺氏菌。目前，在我国仍广泛采用大肠菌群作了志贺氏菌。目前，在我国仍广泛采用大肠菌群作为指标菌，很少以肠杆菌科作为食品卫生指标菌，为指标菌，很少以肠杆菌科作为食品卫生指标菌，但对欧洲出口食品时有肠杆菌科检测计数要求。但对欧洲出口食品时有肠杆菌科检测计数要求。标标 准准 意意 义义 肠杆菌科作为食品卫生指标菌在欧洲已有多年历史，肠杆菌科作为食品卫生指标菌在欧洲已有多年历史，对其检验方法不少学者曾进行了研究。目前北欧食对其检验方法不少学者曾进行了研究。目前北欧食品分析委员会（品分析委员会（NMKL）及）及ISO已制定了食品中肠已制定了食品中肠杆菌科检验的标准方法。包括了直接增菌和前增菌杆菌科检验的标准方法。包括了直接增菌和前增菌的定性方法；菌落计数和带恢复的的定性方法；菌落计数和带恢复的MPN定量方法。定量方法。近年来，随着对外贸易的发展近年来，随着对外贸易的发展,欧洲一些国家己对欧洲一些国家己对我国出口的某些食品和动物饲料提出了检测和限量我国出口的某些食品和动物饲料提出了检测和限量要求。且将其作为国际间食品微生物学实验室质量要求。且将其作为国际间食品微生物学实验室质量控制、水平测试的必测项目之一。控制、水平测试的必测项目之一。速食食品的微生物指标速食食品的微生物指标 肠杆菌科的传统检测法肠杆菌科的传统检测法 平板计数法平板计数法 Violet Red Bile 葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂(VRBG)或或Violet Red Bile 乳糖琼脂乳糖琼脂1葡萄糖葡萄糖(VRBL+G)36 1 C,培养培养24 h,计数红色菌落计数红色菌落(直径直径 0.5 m)MPN法法 煌绿葡萄糖肉汤煌绿葡萄糖肉汤(BGGB)9管管BGGB发酵，发酵，VRBG琼脂分离，生化鉴定琼脂分离，生化鉴定 进出口食品中肠杆菌科检验方法进出口食品中肠杆菌科检验方法 Petrifilm测试片法测试片法 标准文本标准文本 1.范围 本标准规定了进出口食品中肠杆菌科检本标准规定了进出口食品中肠杆菌科检验方法验方法Petrifilm测试片法。测试片法。本标准适用于进出口食品中肠杆菌科的本标准适用于进出口食品中肠杆菌科的计数。计数。2.规范性引用文件规范性引用文件 GB/T 4789.1 食品卫生微生物学食品卫生微生物学检验检验 总则总则 SN 0330 出口食品中微生物学检验出口食品中微生物学检验通则通则 术语和定义术语和定义 肠杆菌科肠杆菌科 Enteroacteriaceae 革兰氏阴性无芽孢杆菌，有周鞭毛，需氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，有周鞭毛，需氧或兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发或兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵利用葡萄糖产酸或产气，氧化酶阴性。酵利用葡萄糖产酸或产气，氧化酶阴性。设备和材料设备和材料 天平：感量天平：感量0.1g。均质器（旋转式或拍击式）。均质器（旋转式或拍击式）。培养箱：培养箱：440.5。放大镜或标准菌落计数器。放大镜或标准菌落计数器。Petrifilm测试片压板。测试片压板。培养基和试剂培养基和试剂 Petrifilm肠杆菌科测试片。肠杆菌科测试片。PetrifilmTM肠杆菌科测试片肠杆菌科测试片 含有改良的含有改良的VRBVRB葡萄糖培葡萄糖培养基养基 肠杆菌科为红色带黄色区肠杆菌科为红色带黄色区域，或带气泡的菌落，或域，或带气泡的菌落，或带有两者的菌落带有两者的菌落 含有酸检测的含有酸检测的pHpH指示剂指示剂 培养时叠放片数小于培养时叠放片数小于2020 培养时间培养时间24 h24 h PetrifilmTM 肠杆菌科测试片肠杆菌科测试片 取样取样 取样和样品运送按取样和样品运送按GB/T 4789.1或或SN 0330规定执行。规定执行。操作步骤操作步骤 样品制备样品制备 液体食品液体食品 无菌取样无菌取样25mL放入装有放入装有225mL稀释液的灭菌容器，振稀释液的灭菌容器，振摇混匀，制成摇混匀，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。固体和半固体食品固体和半固体食品 无菌取样无菌取样25g放入装有放入装有225mL稀释液的灭菌均质杯内，稀释液的灭菌均质杯内，于于8000r/min均质均质1min2min，或无菌取样，或无菌取样25g放放入装有入装有225mL稀释液的灭菌均质袋内，均质器均质稀释液的灭菌均质袋内，均质器均质0.5min1min，制成，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。样品制备样品制备 检样稀释检样稀释 用用1mL1mL无菌吸管吸取无菌吸管吸取1:101:10样品匀液样品匀液1mL1mL，沿管壁缓缓注，沿管壁缓缓注入装有入装有9mL9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及液面），振摇试管或换用要触及液面），振摇试管或换用1 1支支1mL1mL无菌吸管反复无菌吸管反复吹打吹打3 35 5次，或采用振荡器使其混合均匀，制成次，或采用振荡器使其混合均匀，制成1:1001:100的样品匀液。的样品匀液。根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成系列十倍递增样品匀液。每递增稀释成系列十倍递增样品匀液。每递增稀释1 1次，换用次，换用1 1支支1mL1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过过程不得超过15min15min。接种接种 对于每一个样品，选择适宜的对于每一个样品，选择适宜的2个个3个连续稀释个连续稀释度的样品稀释液检验。度的样品稀释液检验。将肠杆菌科测试片置于平坦表面处，揭开上层胶膜，将肠杆菌科测试片置于平坦表面处，揭开上层胶膜，用移液器吸取用移液器吸取1mL稀释液，垂直滴加在肠杆菌科稀释液，垂直滴加在肠杆菌科测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，注意避免产生测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，注意避免产生气泡，将压板（平面朝下）放置在上层膜中央，轻气泡，将压板（平面朝下）放置在上层膜中央，轻轻压下，使稀释液均匀覆盖于圆形的培养基上，切轻压下，使稀释液均匀覆盖于圆形的培养基上，切勿扭转压板，拿起压板，静置至少勿扭转压板，拿起压板，静置至少1min使培养基使培养基凝固。每个稀释度接种凝固。每个稀释度接种2张肠杆菌科测试片。张肠杆菌科测试片。培养培养 接种后的肠杆菌科测试片胶膜面向上置于接种后的肠杆菌科测试片胶膜面向上置于36 C 1 C的培养箱内，培养的培养箱内，培养24h2h。测试片最多可堆叠至测试片最多可堆叠至20片。注意保持培养箱片。注意保持培养箱内湿度，防止纸片失水干燥。内湿度，防止纸片失水干燥。判读与计数判读与计数 培养培养24h 2h后应立即计数，可目测、用标准后应立即计数，可目测、用标准菌落计数器、显微镜来计数。菌落计数器、显微镜来计数。红点带黄色区域，或红点带气泡的菌落，或红红点带黄色区域，或红点带气泡的菌落，或红点带有两者的菌落计数为肠杆菌科。培养圆形点带有两者的菌落计数为肠杆菌科。培养圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不作计数。面积边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养面发亮，且培养区域出现许多小菌落或当培养面发亮，且培养区域出现许多小菌落或小气泡时，说明菌落浓度很高，其结果记录为小气泡时，说明菌落浓度很高，其结果记录为“多不可计”（“多不可计”（TNTC）；要求对样品进行进）；要求对样品进行进一步的稀释，也可获得准确的读数。一步的稀释，也可获得准确的读数。PetrifilmTM 肠杆菌科测试片肠杆菌科测试片 判读判读 计数所有红色带黄色计数所有红色带黄色区域，或带气泡的菌区域，或带气泡的菌落，或带两者的菌落落，或带两者的菌落 计数范围计数范围15-100 方格设计便于计数方格设计便于计数 结果的报告结果的报告 （1）选取菌落数在）选取菌落数在15100之间的测试片作为计之间的测试片作为计数标准。选择菌落数在数标准。选择菌落数在15100之间的稀释度，平之间的稀释度，平均菌落数乘以稀释倍数报告之。均菌落数乘以稀释倍数报告之。（2）如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于）如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。释倍数报告之。（3）如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，）如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以（则以（）1乘以最低稀释倍数报告之。乘以最低稀释倍数报告之。结果的报告结果的报告（4）如果最高稀释度的菌落数大于）如果最高稀释度的菌落数大于100个时，计个时，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，计数菌落数大于数报告之，计数菌落数大于100个的测试片时，可个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以算成单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为算的菌落数（圆形生长面积为20 cm2）。）。（5）最终报告每克（毫升）样品中肠杆菌科数）最终报告每克（毫升）样品中肠杆菌科数（单位以（单位以cfu/g，cfu/mL表示）。表示）。