血红蛋白的提取与分离..ppt

课题课题3 血红蛋白的提取血红蛋白的提取和分离和分离(一）蛋白质一）蛋白质 占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的以上，细胞中含量最多的有机物有机物 2 2、组成元素、组成元素 C C、H H、OO、N N 一、基础知识一、基础知识 1 1、含量、含量 3 3、相对分子质量、相对分子质量 高分子化合物高分子化合物 4 4、基本组成单位、基本组成单位 氨基酸氨基酸 5 5、氨基酸通式、氨基酸通式 R R HH C C COOHCOOH NHNH2 2 6 6、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式 脱水缩合脱水缩合 8 8、分子结构、分子结构 7 7、肽键、肽键 COCO NHNH 氨基酸氨基酸 肽链肽链 蛋白质蛋白质 脱水缩合脱水缩合 盘曲折叠盘曲折叠 （一条或者多条）（一条或者多条）1010、生理功能、生理功能 细胞和生物体的结构物质细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组是人体发育和组织更新的主要原料织更新的主要原料，具有运输具有运输、调节调节、免疫免疫、催化等作用催化等作用，是一切生命活动的主要承担者是一切生命活动的主要承担者 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 9 9、蛋白质结构的多样性、蛋白质结构的多样性 氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计基，另一端只有一个羧基（不计R R基上的氨基和基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个基和羧基都是一个 若有个若有个n n氨基酸分子缩和成氨基酸分子缩和成mm条肽链条肽链,则可形成则可形成n n-mm个肽键个肽键,脱去个脱去个n n-mm个水分子，至有氨基个水分子，至有氨基和和 羧基各羧基各mm个个 1111、相关计算、相关计算 蛋白质可以含有一条或蛋白质可以含有一条或n n条肽链、肽链通过化条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构构 关于蛋白质相对分子量的计算：关于蛋白质相对分子量的计算：n n 个氨基酸形个氨基酸形成成mm条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,a,那么那么由此形成的蛋白质的相对分子量为由此形成的蛋白质的相对分子量为n n a a-(n(n-m)m)1818 1 1、分离生物大分子的基本思路、分离生物大分子的基本思路 选用选用一定的物理或化学一定的物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不同不同物理或化学性质物理或化学性质的生物大分子的生物大分子 2 2、蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可等等，可以用来分离不同蛋白质以用来分离不同蛋白质 (二）蛋白质的提取二）蛋白质的提取 3 3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构 4 4、人们用鸡的红细胞提取、人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人的红细，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进，便于进行行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 （三）（三）凝胶色谱法凝胶色谱法 实例：实例：葡聚糖、琼脂糖葡聚糖、琼脂糖 3 3、凝胶、凝胶 1 1、别名：、别名：分配色谱法分配色谱法 性质：一些性质：一些微小多孔微小多孔的球体，内含许多的球体，内含许多贯穿贯穿的通道的通道 2 2、概念：根据被分离物质的、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子蛋白质相对分子质量的大小，质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的分子分子筛作用，筛作用，来进行分离来进行分离 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道的通道 4 4、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应 分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离得以分离 当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢长，移动速度较慢 5 5、具体过程、具体过程 蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小 4 4、依据的特性、依据的特性 （四）缓冲溶液（四）缓冲溶液 1 1、概念、概念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液稍加稀释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变 2 2、作用、作用 4 4、缓冲溶液的组分分类、缓冲溶液的组分分类 弱酸和弱酸盐组合弱酸和弱酸盐组合 HH2 2COCO3 3 NaHCONaHCO3 3 CHCH3 3COOH CHCOOH CH3 3COONaCOONa 3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围范围内使用的缓冲液内使用的缓冲液 弱碱和弱碱盐弱碱和弱碱盐 NHNH4 4OH NHOH NH4 4CLCL 多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 NaHNaH2 2POPO4 4 NaNa2 2HPOHPO4 4 KHKH2 2POPO4 4 K K2 2HPOHPO4 4 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正常结构和功环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察能，便于观察(红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性)（五）电泳：（五）电泳：1 1、概念、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2 2、原理、原理 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电团会带上正电或负电 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离子的分离 3 3、类型、类型 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 4 4、实例、实例 由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成三维网的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶状结构的凝胶 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量 应用应用 聚丙稀酰胺凝胶聚丙稀酰胺凝胶 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带所带静电荷的多少静电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素 原理原理 SDSSDS作用作用 为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响静电荷对迁移率的影响可以在凝胶可以在凝胶中加入中加入SDSSDS SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解聚成单的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。量。SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小大小 SDSSDS作用机理作用机理 讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位臵，用电泳迁移率和分子量的对数电泳区带位臵，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售标准蛋白试剂出售.二、实验操作二、实验操作 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 1 1、样品处理、样品处理 （一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤 (1)(1)血液组成血液组成 （二）操作过程（二）操作过程 血血液液 血浆血浆 水分水分 固体物质固体物质 血浆蛋白血浆蛋白 无机盐无机盐 磷脂磷脂 葡萄糖等葡萄糖等 血细胞血细胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多）血红蛋白血红蛋白 （9090）两个两个a a肽链肽链 两个两个 一肽链一肽链 四个亚铁红四个亚铁红素基团素基团 成分成分 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可此基团可携带携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因血红蛋白因含有含有血红素血红素而呈红色而呈红色 组成及作用组成及作用 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物脊椎动物的血的血液来分离血红蛋白液来分离血红蛋白 选材选材 (2)(2)红细胞的洗涤红细胞的洗涤 洗涤红细胞目的洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少分离纯化，不可洗涤次数过少 洗涤操作洗涤操作 A A、采集血样、采集血样 B B、低速短时间离心低速短时间离心（速度越高和时间越长会（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）效果）C C、吸取血浆：上层透明