血清清蛋白的分离、纯化和鉴定.ppt

淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定 一、实验目的一、实验目的 1.掌握测定淀粉酶活性的原理掌握测定淀粉酶活性的原理 2.熟悉测定淀粉酶活性操作方法熟悉测定淀粉酶活性操作方法 方法一：方法一：3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性二硝基水杨酸测淀粉酶活性 一、实验目的一、实验目的 1.掌握用掌握用3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活二硝基水杨酸测淀粉酶活性性的方法的方法 2.熟悉熟悉3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性二硝基水杨酸测淀粉酶活性的原理的原理 二、基本原理二、基本原理 1、测量依据、测量依据 淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水解,产生还原糖淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比，可以单位体积样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。2、相关反应、相关反应:：淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸。具体反应式为：三、操作步骤三、操作步骤 实验设备实验设备 试管，滴管，容量瓶，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，电磁炉。1.实验设备：实验设备：三、操作步骤三、操作步骤 （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液；实验试剂及其配制实验试剂及其配制：（3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入；麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中；（5）pH 6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。（6）0.4mol/L的NaOH溶液；（7）淀粉酶溶液 三、操作步骤三、操作步骤 实验步骤实验步骤 淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 (1)取试管：取试管4支,2支为对照管,2支为测定管。(2)装溶液：在2支对照管中分别加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。(3)加试剂：在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液和淀粉酶溶液lml。基本操作基本操作(4)保温：将4支试管置另一个37 恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入37下预热的1淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入37恒温水浴保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。麦芽糖的测定麦芽糖的测定：(1)标准曲线的制作:取试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1,置沸水浴中加热10min，取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线 （操作的关键环节操作的关键环节）样品的测定:取酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂。置沸水浴中加热10min.取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。计算公式：计算公式：相关实验 一、实验拓展一、实验拓展 方法二：方法二：碘碘-淀粉测定淀粉酶活性淀粉测定淀粉酶活性 一、实验目的一、实验目的 1.掌握测定淀粉酶活性的原理掌握测定淀粉酶活性的原理 2.熟悉测定淀粉酶活性操作方法熟悉测定淀粉酶活性操作方法 二、基本原理二、基本原理 原理：淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及糊精。利用已知浓度的淀粉溶液作为底物，加入一定量的淀粉酶，在适应条件下淀粉酶将部分淀粉水解。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与淀粉的浓度成正相关,用分光光度计法测出反应后淀粉的浓度，从而推算出单位体积样品在一定时间内消耗淀粉的量。五、讨论五、讨论 依据血清电泳的结果作为阳依据血清电泳的结果作为阳性对照，判断盐析过滤液中性对照，判断盐析过滤液中有无清蛋白。有无清蛋白。分析所获得的清蛋白纯度分析所获得的清蛋白纯度 分析有无分离获得清蛋白分析有无分离获得清蛋白 根据层析液样品电泳结果中根据层析液样品电泳结果中杂蛋白条带出现的情况，判杂蛋白条带出现的情况，判断分离的清蛋白纯度。断分离的清蛋白纯度。六、结论六、结论