大肠杆菌与遗传测序.pptx

主要通过检测什么检测大肠杆菌：1、菌落数量 2、大肠杆菌生成物间接检测 (-半乳糖苷酶,-葡萄糖醛酸酶)3、表面抗原 4、DNA 主要通过检测什么检测大肠杆菌 1、芯片化的大肠杆菌检测法 1.1、在线富集技术在微流控芯片上实现低浓度细菌微生物超灵敏检测 背景：背景：由于在水、食品和临床样品病菌的感染剂量可能非常低,为了能够快速测量存在于实际样品中低浓度的病原微生物,科研工作中己经投入了相当大的精力到这一领域。本文通过将壳聚糖(CS)扫集,反转电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细菌的高效检测。（了解）由于CS（壳聚糖）带有大量正电荷因此常被用于絮凝吸附剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜表面具有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因此,CS的高吸附能力可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓缩检测方法。（知道）材料和仪器材料和仪器 三羟基甲基氨基甲烧(Tris),硼酸,乙二胺四乙酸(EDTA)购买于Aldrich公司(Milwaukee,WI,USA)。壳聚糖,牛璜酸和半胱氨酸购买于上海国药集团。大肠杆菌、E.coli)购买于广东微生物种质资源库。所有的实验在自制的微流控-激光诱导焚光检测系统(MCE)上实施。微流控系统主要由上海光谱有限公司提供。(了解了解)细菌悬浮液的准备：细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在 LB 培养基 30 度下培养 13 h。在3400 rpm（每分钟转数）离心5min,上清液去除,再次用无菌水对细胞进行清洗,离心,重复这个过程5次以去除残留的培养基并且达到清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO 62用来标记细菌细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约1.0 x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸60-90 S以避免细胞聚集。（了解）微流控芯片系统的条件：微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字”通道微流控芯片微通道深为25 宽为100 um。分离通道长为50 mm,其他通道与交叉口的距离为10 mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯片使用之前需要用98%的浓硫酸和去离子水各冲洗10 min。随后,用1 mol/L NaOH冲洗通道20 min,再用去离子水冲洗10 min,最后用运行缓冲溶液清洗10 min。芯片清洗过后,将含有CS（壳聚糖）的分离缓冲芯片对通道进行预涂敷处理。（参考）微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：对于场放大细菌堆积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将少量的牛磺酸添加到悬浮液中。下图是芯片电泳五步浓缩过程示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓缩。（图）细菌在线富集分离机理示意图。(A)预上样;(B)进样,(C)场放大样品堆集和扫集,(D)反转电场富集,(E)分离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表样品基质,空白代表含有CS（壳聚糖）的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。Analytical Chemistry,2012,84,1687，华东师范大学，王志芳 标准条件下多步浓缩富集方法对大肠杆菌的定量检测曲线。自然水体中大肠杆菌的检测：自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度经常30 CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、SO4 2-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的浓缩方法部分是基于运行缓冲和样品缓冲中不同的电导率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过预富集的细菌水样的浓度必须达到多步浓缩方法的检出限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆菌。多步浓缩富集方法对地表水中大肠杆菌的检测 小结：小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际样品中低浓度细菌的测定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法(CS扫描、反转电场和场放大样品堆积)可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的测定。对比于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样品需耗量和快速分析的优点。（知道）1.2、纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究 综述：综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液滴的PCR系统。液滴微反应器将反应液分隔在单分散体系中,减少了 PCR歧视及非特异性扩增;反应体积可为纳升至皮升级,与细胞体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用;通过不溶相使液滴微反应器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。（知道）背景：背景：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA序列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究证明,miRN A 在很多基因的表达过程中起到了分子开关的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和发展中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对miRNA进行定量检测具有重要的生物学和临床意义。（了解）技术条件：技术条件：实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术,已经广泛地用于分子诊断,疾病研究,临床医学等领域。qPCR技术遵循传统PCR的扩增原理,不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时荧光检测。根据溶液中模板的原始拷贝数的对数与扩增循环数Ct存在的线性关系,对核酸进行定量分析。实时定量PCR技术具有准确度高,灵敏度高及检测范围宽(超过5个数量级)等特点,因此非常适用于miRNA的定量检测。（知道）实验材料及试剂：实验材料及试剂：单晶桂片(N111型):上海齐鸣桂材料有限公司,上海。氧化锡铟(ITO)玻璃(1.1 mm厚,lOohm/m2):深圳莱宝高科技股份有限公司,深圳。AZ4620光胶:安智电子材料公司,苏州。环氧树脂(合众全透明AAA超能胶):浙江黄岩光华胶點剂厂,黄岩。荧光素纳(产品编号:FT0989):上海生工生物工程股份有限公司,上海。氟化铵(NH4F):国药集团化学试别有限公司,上海。氢氧化纳(NaOH):国药集团化学试剂有限公司,上海。浓硫酸(H2SO4):国药集团化学试劍有限公司,上海。氢氟酸(HF):国药集团化学试刻有限公司,上海。硝酸(HN03):国药集团化学试劍有限公司,上海。异辛院:国药集团化学试剖有限公司,上海。无水乙醇(C2H5OH):国药集团化学试剂有限公司,上海。（了解）实验溶液配制：实验溶液配制：硅烷化试剩:将OTCS与异辛烷混合作为硅烷化试剂,体积比为0.1%-1%均可,现用现配。芯片刻姓液分别量取HF16mL、NH4F 7.4 g.HNO319.2 mL.去离子 水364.8 mL在塑料器皿中混勻,配置成摩尔浓度比HF:NH4F;HNO3为1:0.5:0.75的芯片刻烛液,常温保存,可重复使用。光刻显影液:称取0.7 g NaOH固体溶解于100 mL去离子水中,配置成0.7%NaOH溶液,作为光刻显影液。0.1 M荧光素纳溶液:用于多步加样过程的观察。成熟 miRNA-122(mir-122,UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)序列来源于 Sanger Center miRBase,由上海吉玛制药技术有限公司(上海)负责合成。2%RNase清除剖(体积比):使用娃哈哈纯净水稀释RNase清除刻,用于芯片及PCR耗材清洁。（了解）实验芯片：实验芯片：亲水点阵列芯片加工，采用CorelD RAW X3软件绘制芯片掩膜图。硅片为直径76 mm的圆形薄片,每块桂片可加工出7块13X13mm芯片。芯片设计成6 X6点阵,点直径为0.5 mm,间距为1.7mm。（参考）实时定量实时定量RT-PCR系统构建：系统构建：将芯片置于商品化基因扩增仪(MGL96G/Y,杭州朗基科学仪器有限公司)的载物合上,用PCR仪控制热循环温度。将ITO玻璃罩在芯片上方,结合自制的温度控制模块,维持温度恒定,以起到热盖的作用。以汞灯作为荧光激发光源,利用Nikon体视荧光显微镜(SMZ1500,Nikon,Japan)的光路系统采集荧光。用 Labview(Labview 8.0,National Instruments,Austin,USA)程序控制 CCD(电荷耦合器件)和自制的挡光阀,在每个循环退火阶段拍摄荧光照片。（图）实时定量RT-PCR系统示意图，浙江大学，张云霞，2013.04 数据采集处理：数据采集处理：采用自编的Labview程序读取各个循环荧光照片上液滴的荧光强度值,得到荧光强度随反应循环数增加的变化曲线。以各条曲线前10个循环荧光强度值Rn的标准偏差的10倍作为阈值,取大于阈值的循环数作为CT(临界循环次数)值。以加入miRNA-122的拷贝数的对数值作为横坐标,CT值为纵坐标拟合出标准曲线。（了解）Labview数据采集系统软件界面 芯片清洗及注意：芯片清洗及注意：每次使用后,使用医用脱脂棉蘸洗海刻搓洗芯片表面,再分别用去离子水及娃哈哈纯净水冲洗。清洗表面后,将芯片置于2%RNase清除剂中浸泡5min,以减少RNA降解,避免PCR污染。用娃哈哈纯净水冲洗后,在烘箱中65 C-80C烘干30min。清洁后的芯片置于干净的培养皿中,室温存放。实验中经清洗后的芯片不会产生PCR污染,可反复使用。芯片最长使用时间可达一年。本实验全程需佩戴口罩及乳胶手套。芯片硅烷化、光刻及湿法刻烛过程中,使用试刻的挥发性和腐蚀性较强,尽量在通风橱内操作。玻璃研磨过程中要带防护眼镜以保护眼睛。（知道）小结：小结：本工作中,我们发展了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵列平台,并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。利用平面液滴的优势,在经表面修饰的亲水点阵列芯片上,实现了液滴的定位和多步加样操作。该芯片具有加工简单、操作灵活、易于普及等优点,可以作为一种通用型的生物化学反应平台使用。此外,该系统可在试剂消耗、检测通量及系统集成化微型化等方面进一步优化改进,有望在大规模高通量分析领域发挥重要的作用。（知道）1.3、基于纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RT-PCR系统的研究 综述：综述：研究基因型与表现型之间的关系是生物学及医学发展的重要环节,以定量测定细胞内各类RNA表达为目标的转录组研究对于基因表达和分子诊断研究尤为重要。同一器官中的所有细胞具有特定的基因型,而细胞个体之间基因表达却有很大差异,这就造成了细胞亚群的分化,并具有不同的生理功能、应激行为及表现型。由于这种细胞异质性的存在,转录组研究需要在单细胞水平进行。因而，针对单细胞的基因分析为大量细胞中稀少变异细胞的检测提供了方法,特别对重大疾病与癌症的早期诊断、胚胎植入前遗传学诊断、微生物亚群分类及法医鉴定等研究具有非常重要的作用。（了解）实验材料及试剂：实验材料及试剂：溶融石英毛细管:河北永年锐洋色谱器件有限公司 Tygon（聚乙烯）管:Saint-Gobain Performance Plastics,Franceo 微量注射器(10 pL,1701N):Hamilton,Switzerland。DMEM（细胞培养基）高糖培养液:Gibco,Life Technologies,USA。FBS（胎牛血清）:Gibco,Life Technologies,USA。PBS（磷酸盐缓冲液）(PH 7.2):Gibco,Life Technologies,USA。生理盐水(0.9%NaCl溶液):浙江大学校医院,杭