细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术1.pdf

第 2 8卷第 6 期 Vo 1 2 8，No 6 滨 州学 院学报 J o u r n a l o f Bi n z h o u Un i v e r s i t y 2 0 1 2年 1 2月 De c，2 01 2 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术 卢建 美，赵 云峰(曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 2 7 3 1 6 5)摘 要：目前 普遍认 为 细胞 的死亡途 径有 细胞 凋亡、细 胞坏 死及 自噬 3种，其 中细胞 凋 亡一 直是 医学界 为 治疗癌症 而不 懈努 力研 究的方 向，而 自噬是近 几年研 究的 热点 现 对这 3种死 亡方 式及 其各 自的检 测方 法作一 简要概 述 关键词：凋 亡；坏死；自噬；检 测 方法 中图分 类号：Q 2 5 5 文献标 识码：A 文章 编号：1 6 7 3 2 6 1 8(2 0 1 2)0 6 0 1 1 4 0 7 1 凋亡、坏死及 自噬的概述 1 1 细胞 凋亡 细胞 凋亡 现象 由 Ke r r 在 1 9 6 5年首 次发现，并 在 1 9 7 2年 首次 提 出这 一 概念 细 胞 凋 亡(Ap o p t o s i s)是一个主动的由基 因决定 的 自动结束生命 的 过程 在 细胞凋 亡 过程 中，细 胞 膜反 折 包 裹 断裂 的 染 色质 片段或 细胞器 与胞体 分离，形成众 多 的凋 亡 小体，随后凋亡小体被邻近的细胞吞噬，整个过程 中细胞膜保持完整，无 内容物溢 出，从而不会引起 炎症反应 细胞凋亡同增殖一样，是维持机体细胞 数 量动 态平衡 的基本 措施 在胚 胎发育 阶段通 过细 胞凋亡清除多余 的和已完成使命的细胞，保证了胚 胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老 和病变的细胞，保证了机体的健康 细胞凋亡调控 紊 乱会 导致一 系 列疾 病 的 发生，如 自身 免疫 病，阿 尔茨海 默病 等 对 细 胞凋 亡 的研 究 除 了有 助 于 阐明一 系 列免 疫病 的病 发机 制 外，还 能 为 肿 瘤 治 疗 提 供 新 的疗 法，即重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，抑制肿 瘤细胞生存基因的表达，使肿瘤细胞走 向凋亡，而 不 引起 炎症 反应，从 而 不会 影 响 机体 健 康 这 也 正 是细胞凋亡的研究如此受关注的原因 1 2细胞 坏死 细胞 坏 死是 极 端 的物 理化 学 因素 或严 重 的病 理性 刺激 引起 的细胞损 伤和死 亡 坏 死过程 中细胞 器膨 胀变形，染 色质 随机降解，细胞膜 发生 渗漏，导 致细 胞 内容 物释 放 到胞 外，从 而 引起 炎 症反 应 此 外，未得 到及时清 除 的凋亡细 胞也会 发生胞 膜破裂 溶解、胞浆 外泄并 引发 炎 症反 应 的 现象，即发 生 继 发性 坏死，这在体 外培 养细胞 及 巨噬细胞发 生功 能 障碍 的机体 中较 为常见 细胞 坏死 曾被认 为是偶 然 的不能控制的退化，但近期 的研究表明，细胞坏死 可 能是细胞“程 序性死 亡”的另一种形 式，具 有包 括 引 发炎症 反应 在 内的重要生 理功 能 当细胞凋 亡不 能 正常发 生 而 细 胞 必 须 死 亡 时，坏死 作 为 凋 亡 的“替 补”方 式被 采用 1 3 细胞 自噬 1 9 6 2 年，As h f o r d和 P o r t e r在 人 肝 细 胞 中首 次 观察 到 自噬(a u t o p h a g y)_ 1 j 自噬，即 自体 吞 噬，是 一种存 在 于正常 细 胞 和病 态 细胞 中 的非选 择 性 降解机制，是细胞 内长寿蛋 白降解 的主要途径 它 的主要作 用是 在应 激 状 态下 为 细 胞生 长 代谢 提 供 必 要 的大分 子物质 和能量，并清 除细胞 内过剩 或有 缺陷 的细胞 器 在癌 症治疗 中，自噬是 一把 双刃剑，既能抑 制肿 瘤细胞 的生存 又能产 生促 生存效应，造 收 稿 日期：2 0 1 20 42 8 第一作者简介：卢建美(1 9 8 6-)，女，山东滨州 人，硕 士，主要从 事生物化 学与分 子生 物学研究，E ma i l：wa t e r 1 8 6 0 y a ho o C ON c n 第 6期 卢建美，赵云峰细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术 1 1 5 成治疗 抵 抗L 2 如 何调 节 自噬使其 发挥 肿瘤 抑 制活 性，成为肿瘤治疗的新靶点，这是近几年研究 的热 点，所 以对 于 自噬 的检测也 成 了一种 迫切 需要 1 4三者 之 间的关 系 细胞 凋亡、坏死 和 自噬是 3种不 同 的细胞 死亡 方式，共 同维持 着 机体 的 自我平 衡，在 肿瘤 发 生 发 展 中起 重 要 的作 用 一 直 以来，自噬 被认 为 是 一 种 细胞生存的机制，随着研究的深入，发现 自噬具有 双重性，首先是作为 细胞 的保护机制 防止 细胞死 亡，但是当自噬达到一定水平就会促使细胞走向凋 亡_ 3 因此 自噬通 常先 于凋 亡，进 而启 动凋 亡 而 当 发生凋亡的细胞未得到及时清除时便会导致继发 性坏死，出现胞膜破 裂溶解、胞浆外泄并 引发炎症 反应 的现 象 研 究 发 现 其 机 制 为 c a s p a s e酶 能 切 割 与 自噬 有关 的蛋 白 B e c l i n l、At g 5、At g 4 D，导致 B e c l i n l及 At g 5失去 自噬诱 导 活性，而发挥 促 凋 亡作 用 切 割后 的 At g 4 D 自噬活 性 及 促 凋 亡 活 性 均 增 加 由此 细胞从 自噬 走 向凋 亡 凋亡 可 以抑 制 坏 死 坏 死与聚腺 苷 二磷 酸核 糖 聚合 酶(P ARP)导致 的 AT P过度消耗及其产物介导的线粒体凋亡诱导 因 子 释 放 有 关 凋 亡 时 激 活 的 c a s p a s e面 每 切 割 P AR P使其失活，从而抑制 ATP的过度消耗，防止 坏死 发生 王 晓东等人 发 现 了诱 导 细胞坏死 的关 键蛋 白RI P 3 r 7 ，并发现 R I P 3 蛋 白表达量的高低是 控制 细胞凋 亡或 细 胞坏 死 的关 键，如 果 RI P 3表 达 量高，细胞 则走 向坏 死；R I P 3表 达 量 低，细 胞 则 走 向凋亡 由此可见，三 者之 间 的关 系是 比较 复杂 的，三者之 间 相 互 协 调，共 同 维 持 机 体 结 构 及 功 能 的 稳定 2 检测方法 细胞 凋亡、坏 死 及 自噬无 论 在 生 化 代谢 途 径，还是形 态学 方 面都 有 显著 的 区别，可 以根据 其各 自 的特点，运用一定的检测手段将其 区分开来 2 1 细胞 凋亡检 测 2 1 _ 1 细胞 凋亡的 形 态学检 测方 法 凋亡细 胞会 发生形 态学 上 的改变，一般认 为凋 亡细胞的形态学改变是判断其凋亡的基础 在光学 显微镜下可以观察到凋亡细胞大体形态的改变，如 贴壁生长的凋亡细胞外形皱缩、圆化，细胞 的体积 变小，凋亡晚期可 以观察到凋亡小体 经吖啶橙或 H3 3 2 5 8染 色后，在荧 光显 微 镜 下 可 以观 察 到 活细 胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色或蓝色荧光，而 凋亡细胞 核染 色质 的荧 光浓 聚在核 膜 内侧，因此凋 亡 细胞 核 的特征性 形态 可 以被清 晰地辨 认 在 电子 显 微镜下 可 以清 晰 地观 察 到 凋亡 细 胞 超微 结 构 的 改 变，如 细胞 表面微 绒 毛消失，核染 色质凝 聚、边 缘 化，细胞 器集 中，胞 膜起 泡 凋 亡晚期 的细胞 可 观察 到凋亡小体或可见凋亡小体被邻近 巨噬细胞吞噬 的现象 激光 共 聚焦显微 镜 除用 于普通形 态学 观察 外，还 可 以 对 凋 亡 细 胞 内 的 大 分 子 进 行 初 步 定 位嘲 实 验 证 实1 0 t L mo l L 的 MMP T 作 用 于 H1 7 9 2细胞 4 8 h后，倒置 相 差 显 微镜 下 可 以观 察 到凋亡小 体及 胞膜 起泡，荧 光 显微镜 下部 分细胞 呈 现 明显 的染 色质凝 集现象 _ 9 此外 利用 荧光 显微 镜 还可以定性地观察转染效率的高低L 1 形态学观 察法 与其 他方 法 相 比更 形 象、更 直 观、更容 易被 接 受 一般实验研究的首选是进行形态学检测 电镜 形 态学 观察 曾一度 被认 为是 判断凋 亡最 经典、最可 靠 的方法，是 鉴定 细胞凋 亡 的 金标 准l_】然 而形 态 学 检测法 也 有 一 定 的 局 限 性，如 只 能定 性 不 能 定 量，且在 判定 时存 在一定 的 主观性 另外，扫描 电镜 及 透 射 电镜 的样 品 处 理 过 程 比 较 繁 琐，且 价 格 昂贵 2 1 2 凋 亡细胞 的 DNA检 测 分析 细胞 凋亡 的一 个 最 主 要 特 征是 DNA 发 生 核 小体 间 的断裂，产 生含有 不 同数 量核 小体单 位 的片 段，大小 为 1 8 0 2 0 0 b p的整 数 倍，在 进 行 琼 脂 糖 凝胶电泳 时就形 成 了特征 性 的梯状 条带(DNA l a d d e r)但是当凋亡细胞数量少无法直接应用琼 脂 糖 电泳 观察 凋亡 细胞 核 DNA 的变 化 时，可 以通 过 连接介 导 的 P C R专 一性 地扩增 核小 体 的梯形 片 段再 进行 琼脂 糖 电 泳，从 而提 高 检 测 的灵 敏 度 此 外，对凋 亡细胞 DN A 的 检测 分 析 还 包 括 DNA 末 端标 记检 测：原 位 切 口平 移(I S NT)和 D NA 断 裂 的原位末端标记法(T UNE L)其原理都是将标记 的核苷酸连接到断裂 DNA的 3 羟基末端，再通过 酶联显色或荧光检测定量分析结果 酶联免疫吸附 法(E L I s A)也是常用的检测细胞凋亡的方法，其原 理是在吸附有组蛋 白抗体的微孔板上加入核小体 1 1 6 滨 州学 院学报 第 2 8卷 上清液，核小体组蛋 白与抗体结合，当加入过氧化 物酶 标 记 的 D NA 抗 体 后，它 们 与 核 小 体 上 的 D NA 结合，并 对过 氧化 物酶底 物产生 显 色反应，再 用酶 标仪 对凋 亡细胞进 行定 量分 析 罗迪贤等人证实 T OF A 和 D NR处理 的细胞 经琼 脂糖凝 胶 电泳后，其 DNA 出现 特征 性 的梯 状 条 带l】TUNE L染 色后，经 电针 刺处 理 的小 鼠大 脑 皮层 变薄并 伴 有 局 部神 经 元 丢 失口 经 E I I S A 法 证实，随着 MMP T 作用 时 间 的延 长 和药 物浓 度 的增加，肺癌 H1 7 9 2细胞内核小体水平逐渐升高，表 明凋 亡细 胞数 逐 渐 增 加l_ 9 D NA 检 测 分 析 与 电 镜检测 法一样 也被认 为 是判断 细胞凋 亡 的金标准，但 是 它只 能对晚期 凋亡 细胞进行 检测 琼脂 糖凝胶 电泳法 简单 易行，但 灵 敏度 不 高，且 需 要 的细 胞 数 量较 多 TUNE L荧 光 素 标 记 法 灵敏 度 高，且 可 以 测定在 细胞 周期 中 D NA发 生 断 裂 的具体 时相，但 是不 能检 测只发 生 D NA 大 片段 断裂 的凋亡 细胞，不 能定量，且容 易 出现坏 死 细 胞 的假 阳性 E I I S A 法不 需要 特殊仪 器，但 不能精 确测 定凋亡 发生 的绝 对 量 2 1 3 细胞 凋亡相 关基 因的表 达检 测 细胞 凋亡 时有些 基 因表达异 常，这些 基 因的产 物促 进 或抑制 凋亡发 生 因此检测 这些基 因的表达 也 成 了确定 细胞是 否发生 凋亡 的手段 之一 基 因的 表达包 括转 录和 翻译 两个 过程，因此 可 以分 别从转 录水平 和翻译 水平 进行检 测 (1)相关 基 因转录水 平 的检测 R T P C R检测 凋亡 相关基 因 的表达