细菌DNA提取方法比较-沈德新.pdf

1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/凝血酶治疗新生儿消化道出血31例河南省新乡县人民医院(453731)崔兴杰 史百川 张雅惠 摘要 目的:观察凝血酶治疗新生儿消化道出血的疗效。方法:凝血酶200u溶于生理盐水510ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用35次。结果:显效22例,有效8例,无效1例,总有效率9618%。结论:应用凝血酶治疗新生儿消化道出血,疗效显著,治疗未出现严重的不良反应。关键词 凝血酶 新生儿消化道出血 新生儿消化道出血是一种儿科常见且严重危及新生儿生命的疾病之一,我科自1999年3月2002年3月三年间,应用凝血酶治疗新生儿消化道出血31例,取得满意效果,现报告如下:1 临床资料111 一般资料:本组均为住院病例,31例中男17例,女14例,足月顺产新生儿5例,早产17例,低出生体重儿6例,难产儿5例,原发病为新生儿窒息10例,缺氧缺血性脑病5例,颅内出血3例,胎粪吸入综合征7例,首发消化道出血6例,呕血,排柏油样便7例,伴休克及全身衰竭1例,血红蛋白均降低,最低达63g/L,血小板 6min 2例,凝血酶原时间 22s 2例。112 方法及结果全部病例均给予静脉注射维生素K1,出血量大或重度贫血者予以输血,在上述治疗的同时,给予凝血酶200u溶于生理盐水510ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用35次。113 疗效评定标准:显效:连用35次后,未再呕血,大便从柏油样转为黄色或从暗红色转为柏油样;有效:连用35次后,呕血减少,原排暗红色血便改排柏油样便,持续2天以上者,或显效后再发少量出血,按原方案治疗后,达显效者;无效:连用35次后,未达到有效标准或加剧者。31例中,显效22例,有效8例,无效死亡1例。总有效率9618%,治疗中未发现毒副反应。2 讨论新生儿消化道出血是一种常见病,尤其在早产儿,低出生体重儿和各种危重病患儿更易发生,因为这些新生儿血小板破坏增加而致血小板减少,或因维生素K依赖性凝血因子缺乏,或因血管壁薄弱,脆性高,易于损伤,容易引起消化道出血。再者危重病患儿易发生消化道溃疡而致消化道出血。凝血酶是一种局部止血药,它在接触出血病灶后会形成条索状凝固膜,有收敛作用和促进平滑肌收缩,降低毛细血管通透性,减轻局部水肿,起止血作用,同时它能直接作用于纤维蛋白原,促进溶胶状态的纤维蛋白原迅速生成不溶性纤维蛋白,堵塞出血点,它还能促进血小板发生不可逆性聚集,并释放血小板因子、ADP及血栓收缩蛋白增加因子、的活性,激活因子 活化,使疏松的纤维蛋白凝块变成紧密的纤维蛋白块,起加固止血作用。所以,凝血酶对新生儿各种原因引起的消化道出血有确切可靠的止血作用,并且无毒副作用,值得推广应用。(收稿日期:2003-12-02)细菌DNA提取方法比较解放军第153中心医院儿科(郑州 450042)沈德新 封志纯 杜 江 摘要 目的:比较细菌DNA4种提取方法的优缺点。方法:采用水煮法、传统法、Genmiction DNA Kit法、E.ZNA法分别制备18种细菌DNA,比较4种方法提取DNA纯度及量的差异。结果:4种方法制备的DNA均可成功应用于PCR扩增,水煮法与E.ZNA法提取DNA量都较大,但前者纯度低于后者;Genmiction DNA Kit法提取DNA纯度高,但量较低;传统法提取的DNA量及纯度均较低,但经济、可靠。结论:4种方法各具特点,应根据实验目的选用。关键词 细菌 DNA提取 细菌DNA分子水平诊断是临床医学发展趋势。目前,细菌DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同,本文对四种不同DNA提取方法进行比较,旨在为合理选取DNA提取方法提供指导。1 材料与方法111 材料11111菌株来源:18种菌株,其中金黄色葡萄球菌26112、ATCC 27154,绿脓假单胞菌ATCC 27316、ATCC 27853,产气肠杆菌45103,阴沟肠杆菌45301,大肠埃希氏菌ATCC25922、44106、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031,肺炎链球菌31126,表皮葡萄球菌26069,乙型溶血性链球菌32210,费劳地枸橼酸杆菌48008,婴儿沙门氏菌50204,流感嗜血杆菌NCTC7279,粪链球菌ATCC 14506,葡萄球菌26103等17株购自北京药品生物制品检定所,金黄色葡萄球菌ATCC 25923购自中山医科大学微生物室。11112 主要试剂:溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、平衡重蒸酚、Tris、SDS(均购自华美公司,为分析纯);EDTA、丙酮、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、无水乙醇(均为广州市化学试剂厂生产的分析纯),Genomic DNA Kit(Fermentas公司生产),E.ZNA kit(Omega公司生产),100bpMarker(申能博彩),DNA扩增试剂盒02中原医刊2004年5月第31卷第10期 Central Plains Medical Journal May.2004,Vol 31,No.10 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/及TaqDNA多聚酶(购自欧瑞卡)。11113 主要仪器:梯度PCR扩增仪(德国Biometra公司产品),紫外分光光度计(Beckman DU-520),TGL-16G台式高速离心机(医用分析仪器厂生产),凝胶图像分析仪(GELDOC1000,BIO-RAD公司产品),紫外透射仪(天能科技公司生产),H6微型电泳槽,电热恒温水浴锅C286型,-20 冰箱。11114 引物设计:通过Internetd检索在Genebank中所有常见细菌16SrRNA的基因序列,利用dnastar软件设计一对细菌的共同引物:上游:5tcctacgggaggcagcagt3 下游:5tggac2taccagggtatctaatc3 由上海生物工程公司合成。PCR扩增片段大小为468bp.112 方法11211细菌DNA提取:取含118108菌的菌液加入115ml的离心管中7500rpm/min离心5min,弃上清。1121111 水煮法1:革兰氏阴性杆菌沉淀加入016ml无菌去离子水,振荡混匀,100水浴10min后离心,上清作为DNA模板-20 保存备用。革兰氏阳性菌及革兰氏阴性球菌沉淀加入800ul丙酮后混均,放入-20冰箱中冰浴10min,7500rpm/min离心5min,弃上清,沉淀在室温下放置5min,使丙酮蒸发干。再加入TE 100ul、10mg/ml溶菌酶100ul,37 温育20min,离心,沉淀加入TE600ul重悬,再加入15mg/ml蛋白酶K25ul,55 温育1h后煮10min,离心,上清作为DNA模板-20 保存备用。1121112传统法2:细菌沉淀加入TE567ul重悬,加入10%SDS 30ul和20mg/ml蛋白酶K 3ul,于37 温育1h,加入5mol/L NaCl 100ul,CTAB/NaCl 80ul溶液,于65 温育10min,加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心5min。上清液转入一个新管加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5min,上清液再转入一只新管中,加入016体积异丙醇,轻轻混合,离心5min,弃上清,加入70%乙醇洗涤1min,离心,弃上清,将沉淀的DNA溶于100ul的去离子水中,-20 保存备用。1121113Genomic DNA Kit方法:TE 200ul重悬细菌沉淀,加入试剂盒提供的lysis solution 400ul 65 孵育5min,加入氯仿600ul,混均,离心2min,上清转入事先准备好的加入消毒去离子水720ul及试剂盒提供的precipitation solution 80ul新的离心管,室温下放置2min,离心2min,弃上清,再加入试剂盒提供的112M Nacl Solution100ul及冷乙醇300ul,-20放置10min,离心4min,弃上清,去离子水100ul溶解DNA,-20 保存备用。1121114E.ZNA Kit法:TE100ul重悬细菌,革兰氏阴性细菌加入10mg/ml溶菌酶,革兰氏阳性细菌加入100mg/ml溶菌酶,30孵育10min后离心,弃上清。用试剂盒中提供的Buffer BTL 200ul重悬细菌,加15mg/ml蛋白酶K 25ul,55 水浴1h,加入试剂盒提供的Buffer BDL 220ul,70 水浴10min,加入无水乙醇220ul,混均,转入试剂盒提供的Hibind自旋柱内,自旋柱装入新的2ml离心管内,离心1min,弃离心管,柱子重新装入新的2ml离心管中,加DNA Wash Buffer750ul于柱中,离心1min,弃离心管。把柱子置于115ml离心管中,并加入70预热的去离子水200ul,柱子在室温下放置1min,离心1min,收集从柱子上洗脱的DNA,重复上一步,共收集DNA溶液400ul,-20 保存备用。11212DNA纯度、质量检测:取细菌DNA 20ul,TE稀释至100ul,在紫外分光光度计下测量A260nm、A280nm OD值,计算DNA纯度、质量。11213 细菌DNA扩增:将上述4种方法提取的细菌DNA作为模板加入总体积为50ul的反应体系中:5butter 10ul,2.5mmol/L dNTP,5uM上游引物5ul,5uM下游引物5ul,DNA模板8ul,Taq酶115u,加去离子水至50ul,混均。95 变性5min,30个循环9440s,5530s,7240s;最后一个循环72 延伸5min。取8ul PCR反应产物,115%琼脂糖凝胶(60V)电泳40min,置紫外透射仪下观察DNA特异性条带。113 统计学处理:采用SPSS1010软件进行完全随机设计的方差分析,各组间两两均数的比较用Drnnetts法。2 结果2114种方法提取的细菌DNA量和纯度分析结果见表1。表14种方法提取细菌DNA纯度和产量比较 方法细菌样本数(N)纯度(OD260/280)(XSD)产量(ugDNA/107菌)(XSD)水煮法181.700.10241.9222.353 传统法181.720.1335.889.72Genomic DNA Kit法181.870.103 27.8819.09E.ZNA kit181.940.063 106.4192.523 注:3 与传统法比P 0105,与Genomic DNA kit法比P 0105,与水煮法比P 0105,与E.ZNAkit比P 0105。212 细菌DNA扩增:4种方法均扩增出468bp目的基因,扩增效果见图1,PCR产物无拖带与杂带,得到满意的扩增效果。图1 细菌DNA为模板PCR扩增产物电泳结果注:DNA模板:1、5、9、13为金色葡萄球菌ATCC 27154,2、6、10、14为绿脓假单胞菌ATCC 27316,3、7、11、15为肺炎克雷伯氏菌ATCC10031,4、8、12、16为肺炎链球菌31126;DNA提取方法:14为E.ZNA kit法,58为Genomic DNA Kit法,912为传统法,1316为水煮法;17为100bpMarker2134种方法提取细菌DNA的步骤、时间、费用见表2。表24种方法所用的步骤、平均时间、成本费比较水煮法传统法Genomic DNA Kit法EZN.A Kit步骤数147512时间(min)151201203090成本(元/份)01521515103 讨论细菌DNA提取方法有多种,不同的方法提取的量及纯度不同,所需要的时间及经费也有差别,而不同实验应用的目的要求也各异。比较4种方法优缺点,为合理选择DNA的提取方法提供指导。4种方法制备的DNA均成功应用于PCR扩增,扩增产物12中原医刊2