细胞凋亡研究新方法-李凌20130417.pdf

Advance in ApoptosisAdvance in Apoptosis研究生命活动的完整解决方案研究生命活动的完整解决方案李凌BD Application specialist2013.4.17细胞凋亡概述细胞凋亡概述 又称为程序性细胞死亡又称为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)是机体是机体主动的、高主动的、高度有序度有序地清除无用细胞的过程。和地清除无用细胞的过程。和细胞坏死细胞坏死(Necrosis)相区别，坏相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。程。薄膜有小泡状形成薄膜有小泡状形成 细胞凋亡与疾病的关系细胞凋亡与疾病的关系 5 细胞凋亡事件发生表细胞凋亡事件发生表 细胞膜事件 线粒体事件 Caspase事件 细胞核事件 1.细胞膜变化的检测：细胞膜变化的检测：Annexin V/PI 磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸(PS)的检测：早期凋亡的检测：早期凋亡 早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定检测及结果判定 早期凋亡特征：早期凋亡特征：磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定检测及结果判定 Annexin V-FITC PI 细胞膜变化的检测：细胞膜变化的检测：Annexin V/PI 优点：优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞 样本设置：样本设置：1.空白对照：空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。2.阴性对照：阴性对照：未诱导的，Annexin V/PI双染，细胞绝大部分都 在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非 特异性结合。3.单阳样本：单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿 4.单阳样本：单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿 注意事项：注意事项：1.细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性 2.贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子 Annexin V检测常见问题检测常见问题 1.是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种?Annexin V试剂盒可以检测多种属 2.这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织?No.上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的样本建议用免疫荧光技术(Cat.No.550911)3.是否与细胞表面标记兼容?CD11B/MAC-1 LY-71 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做 BD Annexin V 流式检测试剂盒流式检测试剂盒 Kit Cat no.Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I 556547 Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains unlabeled recomb.Annexin V 556570 Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I 559763 提供FITC,PE,APC,CY5,CY5.5,BD Horizon V450,BD Horizon V500等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。2.线粒体水平的检测线粒体水平的检测 激活Caspase 9激活Caspase 3启动细胞凋亡 凋亡与线粒体膜电位的去极化相关 BD Mitoscreen(JC-1)Cat#551302 25 tests JC-1:可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素 原理：原理：JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（FL-2 Channel）；细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降低，JC-1 以单体形式存在于胞浆内，荧光 强度减弱甚至消失，故用荧光信号的变化判别凋亡的发生。操作简单，试剂直接加入细胞中，操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测分钟后检测 2.线粒体水平的检测线粒体水平的检测 JC-1检测结果流式图检测结果流式图 JC-1(Fl-1)Jurkat T Cells Mouse Thymocytes Control Staurosporine Camptothecin Fas mAb R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 Control JC-1(Fl-2)3.凋亡相关酶的检测凋亡相关酶的检测-Caspase 背景知识背景知识 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活=细胞凋亡 检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。Caspase-3 data（FCM）Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit Cat No.FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550480 PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550914 Caspase-3 Kits Jurkat T-Cells 6 M camptothecin for 4 h untreated Caspase-3 data（IHC）PARP cleaved Caspase 3水解产物水解产物 PARPs：一类由DNA链断裂而被激活的DNA 修复酶。PARP可以被Caspase-3水解成两个大小分别为24-和89-kDa的片段而失活 PARP cleaved是凋亡细胞中活化的Caspase-3水解产物，代表?酶失去活性 细胞凋亡的标志 Hela 细胞细胞 A.未处理组 B.星孢菌素处理组裂解的PARP cleaved阳性 Jurket细胞用不同浓度的喜树碱处理结果 PARP cleaved Caspase 3水解产物水解产物 化疗前后胃癌活检标本中化疗前后胃癌活检标本中PARP Cleaved+细胞细胞 4.细胞核细胞核DNA检测检测 凋亡晚期 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。检测方法 Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋亡百分比 末端转移酶标记技术 细胞核细胞核DNA检测原理：检测原理：APO-BrdU TdT:脱氧核糖核苷酸末端转移酶 Brd UTP的渗入率显著高于d?，因此检测灵敏度高 TUNEL法法:流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡 APO-DIRECT KIT 50 tests cat.556381 Part A (store at 4)Part B(store at 20)PI/Rnase staining buffer FITC-dUTP Reaction buffer Negative control cells Rising buffer Positive control cells Wash buffer TdT Enzyme 一步法一步法 实验用2种染料 PI染色总DNA：得到细胞周期的信息；FITC-dUTP染色凋亡细胞：检测凋亡。在流式细胞仪488nm激发下，PI发射约623nm荧光，FITC发射520nm荧光。APO-BrdU KIT 60 tests cat.556405 Part A (store at 4)Part B(store at 20)FITC-Labeled Anti-BrdU mAb Br-dUTP PI/Rnase staining buffer Reaction buffer Negative control cells Rising buffer Positive control cells Wash buffer TdT Enzyme 二步法二步法 PI染色检测细胞周期 FITC染色检测凋亡（如果不需要周期信息，则可不做PI染色步骤）TUNEL法法:流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡 26 总结总结 细胞增殖研究方法细胞增殖研究方法 细胞增殖细胞增殖与凋亡对于维持机体内环境稳定和发展具有重要意义。细胞增殖通常体现为细胞数目增多和/或细胞分裂。无序的细胞增殖将可能引发多种病变，如白血病、癌症等。研究细胞增殖的方法：研究细胞增殖的方法：1.细胞染料BD Horizon VPD450 和CFSE方法 2.新合成的DNA检测，如-Brdu 3.增殖蛋白，如PCNA、Ki-67等 BD Horizon Violet Cell Proliferation Dye 450(VPD450)VPD450是非荧光的酯化染料，酯类基团能使染料进入胞内，一旦染料进入细胞内，酯酶切断酯基团后在细胞内产生荧光。随着每次细胞增殖，细胞内的荧光强度会随之衰减，由此可判断细胞的增殖情况。（原理如同CFSE）细胞增殖和细胞因子表达细胞增殖和细胞因子表达 VPD450 Day 1 Day 2 Day 3 Condition:A:CD3/CD28 B:A+IL-1b/IL-6 C:B+TGF-b D:C+IL-23 Cat no:562158 BD Horizon Violet Proliferation Dye 450 新合成新合成DNA检测检测-Brdu Brdu：在细胞增殖过程中，Brdu插入到新合成的DNA中，检测为阳性。FITC BrdU Flow Kit Cat No.559619(50 tests)Cat No.557891(4 x 50 tests)APC BrdU Flow Kit Cat No.552598(50 tests)Cat No.557892(4 x 50 tests)细胞增殖细胞增殖-增殖蛋白增殖蛋白 Ki-67：与增殖密切相关，见于G1、S、G2和M期，G0期没有此抗原。Ki-67指数代表了细胞增殖的程度。PCNA：增殖细胞核抗原。细胞周期蛋白(Cyclins)、视网膜母细胞瘤(Rb)：细胞周期不同阶段蛋白水平上下波动。40BD生物科学流式整体方案提供者COE卓越中心卓越中心400热线电话热线电话Cytometry流式技术流式技术BBS&网络课堂网络课堂BD流式资讯新浪微博流式资讯新浪微博BD生物科学中文网生物科学中文网BD ProductsBD生物科学流式整体方案提供者 卓越中心卓越中心 Center of Excellence（COE）前所未有的流式前所未有的流式4S体验体验 Showcase 产品展示 Support 技术支持 Service 售后服务 Survey 用户调查 BD生物科学热线电话生物科学热线电话:400-819-9900 产品咨询 技术解答 仪器维修 意见反馈“Flying COE”“Flying COE”火热报名中 我是我是BD Accuri C6,我是“我是“Flying COE”的主角的主角体积小巧，功能强大的我，愿意飞到任何您需要的地方；电压，曾让无数初学者头痛心伤，现在大不一样，不调电压，结果依然漂亮；相信我，我会开启流式新时代！我是我是BD Accuri C6，我为自己代言。，我为自己代言。400-819-9900（周一（周一-周五：周五：9：00-18：00）Juan_BD生物科学流式整体方案提供者 BD生物科学中文网生物科学中文网 内容及时更新，海量资料下载 在线联系BD支持人员 Cytometry流式技术流式技术BBS&网络课堂网络课堂 资料查询和在线讨论 两周一次专家在线讲课互动 新浪微博新浪微博BD流式资讯流式资讯 好玩，好看，流式也时尚强大的技术团队强大的技术团队-选择选择BD，选择无忧！，选择无忧！BD的宗旨的宗旨:帮助人类健康生活帮助人类健康生活!