细胞培养基本知识手册(中文版).pdf

0110?细胞培养基本知识|i目录引言 .1手册目的.1细胞培养简介 .2什么是细胞培养？.2有限细胞系与连续细胞系 .2培养条件 .2冻存.2培养细胞的形态.3细胞培养的应用.3细胞培养实验室.4安全 .4生物安全性等级.4安全数据表.5安全设备 .5个人防护设备(PPE).5实验室安全规范.5细胞培养设备 .6基本设备 .6扩增设备 .6其他用品 .6细胞培养实验室 .7无菌工作区域 .7细胞培养通风橱.7细胞培养通风橱布局 .8培养箱 .9储存.9低温储存 .10细胞计数器.10无菌技术.11简介.11无菌工作区域 .11良好的个人卫生.11无菌试剂和培养基 .12无菌操作 .12无菌技术核对表 .13ii|细胞培养基本知识目录生物污染.14简介.14细菌 .14酵母.15霉菌.15病毒.16支原体 .16交叉污染 .17抗生素的使用 .17细胞培养基本知识.18细胞系.18选择合适的细胞系 .18获取细胞系.18培养环境.19贴壁培养与悬浮培养 .19培养基 .20pH 值 .21二氧化碳 .21温度.21细胞形态.22哺乳动物细胞 .22哺乳动物细胞形态差异.22293 细胞的形态 .23昆虫细胞.24Sf21 细胞的形态.24Sf9 细胞的形态.25方法 .26细胞培养维持指导原则.26什么是传代？.26何时传代？.27常用细胞系推荐使用培养基.28贴壁细胞的解离.30TrypLE 解离酶.30贴壁细胞的传代 .31所需材料 .31贴壁细胞传代流程 .31贴壁昆虫细胞传代的注意事项.32细胞培养基本知识|iii目录悬浮细胞的传代 .33悬浮细胞的传代.33悬浮培养容器 .33所需材料 .34悬浮细胞传代流程 .34悬浮昆虫细胞传代的注意事项.36细胞的冷冻 .37冻存.37细胞冻存指导原则 .37冻存培养基.38所需材料 .38培养细胞冻存方案 .39冷冻细胞的解冻 .40细胞解冻指导原则 .40所需材料 .40冷冻细胞解冻方案 .40支持技术方案 .41利用血球计数器进行细胞计数.41台盼蓝拒染法 .42浓缩细胞 .42附录 .43疑难解析.43细胞培养产品 .44细胞系 .44哺乳动物细胞培养基 .45昆虫细胞培养基.46细胞培养用血清产品 .46细胞培养用实验试剂 .47抗生素和抗真菌剂 .48细胞培养用辅助产品 .49生长因子和纯化蛋白 .49转染和选择.50转染试剂 .51其他资源.52哺乳动物细胞和昆虫细胞培养.52细胞与组织分析.52转染选择工具 .52安全数据表.52分析证书 .52技术支持.53iv|细胞培养基本知识引言细胞培养基本知识|1手册目的细胞培养基本知识随身手册是对细胞培养基本知识教学视频( 与连续细胞系正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这种细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过被称为转化的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。培养条件各种细胞的培养条件相差很大，但是细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(O2、CO2)，并可调节其物理化学环境(pH、渗透压、温度)。大多数细胞均具有贴壁依赖性，必须贴附在固体或半固体基质上培养(贴壁或者单层培养)，而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长(悬浮培养)。冻存如果传代时有多余的细胞，可通过适当的保护剂(例如：DMSO 或甘油)处理细胞，储存在 130C 以下的温度下(冻存)，直到需要使用之时。有关细胞传代培养和冻存的更多信息，请参阅第 26 页至第 40 页的“培养细胞维持指南”部分。细胞培养基本知识|3第一部分.引言培养细胞的形态根据形状和外观(即：形态)可将培养的细胞分为三大类。成纤维细胞(或者成纤维细胞样细胞)为双极或多极细胞，呈细长形，贴附在基质上生长。上皮样细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面。细胞培养的应用细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生理和生化(例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物(例如：疫苗、治疗性蛋白)的大规模生产。细胞培养在上述领域应用的主要优势在于，可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果。4|细胞培养基本知识细胞培养实验室安全除了大多数日常工作场所共有的一些安全风险例如电击和火灾之外，细胞培养实验室由于要操作和处理人或动物细胞和组织以及一些有毒、有腐蚀性或者有致突变性的溶剂和试剂，因而还具有一些特殊的危险。其中，最常见的一些危险包括：注射器针头或者其他污染锐器刺伤、液体泼溅到皮肤和粘膜上、经口吞入毒物以及吸入感染性气体挥发。任何生物安全程序的基本目的都是为了减少或避免实验室工作人员和外部环境与潜在危害性生物物质的接触。细胞培养实验室中最重要的安全要素是严格遵守标准微生物学准则和技术。生物安全性等级美国生物安全性法规和建议包含在由美国疾病预防控制中心(CDC)和国立卫生研究院(NIH)制定、美国卫生和福利部颁布的微生物和生物医学实验室生物安全文件中。该文件规定了四个逐级升高的控制等级，依次称为生物安全 1 级至 4 级，介绍了按照操作某一制剂时对应的危险等级应遵守的微生物学准则、应使用的安全设备以及应采取的设施安全措施。生物安全 1 级(BSL-1)BSL-1 为适合大多数研究和临床实验室的基础防护等级，适用于不会导致健康正常人发生疾病的物质。生物安全 2 级(BSL-2)BSL-2 适用于经口吞入或者经皮肤、粘膜接触会导致人发生不同严重程度疾病的中度危险性物质。大多数细胞培养实验室至少应达到 BSL-2 等级，但是确切要求取决于所用细胞系以及开展的工作类型。生物安全 3 级(BSL-3)BSL-3 适用于已知可能会通过气体挥发传播的本地或外来性物质以及可导致严重、甚至致命感染的物质。生物安全 4 级(BSL-4)BSL-4 适用于具有高度个体风险、可通过感染性气体挥发导致威胁生命的不治之症的外来性物质。应将此类物质控制在高防范等级的实验室内。有关生物安全等级指导原则的更多信息，请参阅微生物和生物医学实验室生物安全第五版，该文件可从 www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm 下载。细胞培养基本知识|5第二部分.细胞培养实验室安全数据表(SDS)安全数据表(SDS)，又被称为材料安全数据表(MSDS)，是一种包含某物质各种属性信息的表格。SDS 中包括诸如熔点、沸点和闪点等物理数据、有关该物质毒性、反应性、健康影响、储存和处置的信息，以及应对泼溅的推荐防护设备和措施。所有 Invitrogen 产品的安全数据表均可登录 查阅。安全设备细胞培养实验室的安全设备包括初级屏障，例如：生物安全柜、密闭容器及其他用于消除或尽量减少危险品接触的工程控制设备，以及常与初级屏障配合使用的个人防护设备(PPE)。生物安全柜(即：细胞培养通风橱)是最重要的安全设备，可以限制多种微生物学操作产生的感染性泼溅或气体挥发，并可防止您培养的细胞受到污染。更多信息，请参阅第 7 页的“细胞培养通风橱”部分。个人防护设备(PPE)个人防护设备(PPE)在人员与危险品之间形成一道直接的屏障，包括用于个人防护的物品，例如：手套、实验室工作服和隔离衣、鞋套、靴子、呼吸器、面罩、防护镜或护目镜。个人防护设备常与生物安全柜及其他可限制所操作物质或材料的装置配合使用。我们建议您参阅您所在机构的指南，在实验室中采用合适的个人防护设备。实验室安全规范下列建议仅为实验室安全规范的指导原则，不应将其视为完整的工作准则。请咨询您所在机构的安全委员会，遵守当地有关实验室安全的规章制度。有关微生物学标准规范的更多信息以及具体生物安全等级指导原则，请参阅微生物和生物医学实验室生物安全第五版(www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm)。必须始终穿戴适当的个人防护设备。手套污染时应更换，将用过的手套与其他污染的实验室废物一起处置。操作可能具有危害的物质后以及离开实验室前应洗手。在实验室内不得进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、涂抹化妆品或者存放供人食用的食物。遵守所在机构关于锐器(即：针头、手术刀、吸管和破裂的玻璃器皿)安全操作的准则。小心操作，尽量避免形成气体挥发和/或泼溅。实验开始前、结束后以及可能具有传染性的物质发生泼溅时，应立即使用适当的去污剂对所有工作台面进行去污。无论实验室设备是否被污染，均应定期进行清洁。在对可能具有传染性的物质进行处置前应先去除污染。发生事故可能导致感染性物质暴露时，应向相应人员(例如：实验室主管、安全员)报告。6|细胞培养基本知识第二部分.细胞培养实验室细胞培养设备细胞培养实验室的具体要求主要取决于开展的研究类型；例如：专业从事癌症研究的哺乳动物细胞培养实验室与从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验室的需求相差甚大。但是，所有细胞培养实验室都要求内部没有致病性微生物存在(即：无菌)，并且均有一些相同的细胞培养必需基本设备。此部分列出了大多数细胞培养实验室共有的一些设备和用品，以及可使工作更为高效、准确或者可提高检测和分析范围的实用性设备。请注意此列表并非无所不包；任何细胞培养实验室的需求均取决于其所开展的工作类型。基本设备 细胞培养通风橱(即：层流通风橱或生物安全柜)培养箱(推荐使用湿式二氧化碳培养箱)水浴锅 离心机 冰箱和冰柜(20C)细胞计数器(例如：Countess 自动细胞计数器或血球计数器)倒置显微镜 液氮(N2)冷冻柜或冻存容器 灭菌器(即：高压灭菌器)扩增设备 抽吸泵(蠕动泵或真空泵)pH 计 共聚焦显微镜 流式细胞仪其他用品 细胞培养容器(例如：培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板)吸管和移液器 注射器和针头 废物容器 培养基、血清和试剂 细胞细胞培养基本知识|7第二部分.细胞培养实验室细胞培养实验室无菌工作区域细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养工作区域处于无菌状态。尽管最好设置独立的组织培养室，在较大的实验室内划出的细胞培养区域同样可用于无菌操作、孵育以及细胞培养物、试剂和培养基的储存。获得无菌条件的最为简单、经济的方式就是使用细胞培养通风橱(即：生物安全柜)。细胞培养通风橱细胞培养通风橱可提供无菌工作环境，同时限制多种微生物学操作产生的感染性泼溅或气体挥发。目前已经开发出 I 级、II 级和 III 级三种细胞培养通风橱，以适应不同的研究和临床需要。细胞培养通风橱的分类I 级细胞培养通风橱配合良好的微生物学技术，可为实验室工作人员和环境提供相当水平的防护，但是此类通风橱无法防止培养物污染，其在设计和空气流动性上均与化学通风橱类似。II 级细胞培养通风橱用于涉及 BSL-1、2 和 3 级物质的工作，同样可为细胞培养实验提供必需的无菌环境。II 级生物安全柜适用于操作可能具有危害的物质(例如：来源于灵长类动物的培养物、被病毒感染的培养物、放射性同位素、致癌性或毒性试剂)。III 级生物安全柜为气密性设备，可为工作人员和环境提供能够达到的最高等级的防护。III 级生物安全柜适用于涉及已知人类致病原及其他 BSL-4 级物质的工作。细胞培养通风橱的气流性质细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的 HEPA 过滤空气流动，保护工作环境免受灰尘及其他空气污染物污染。气流可以呈水平方向，与工作台面平行吹过，或者也可呈垂直方向，从通风橱上方吹向工作台面。根据设计的不同，水平流通风橱可为培养物(即：空气吹向使用者)或者使用者(即：空气由通风橱内的负压经前方吸入)提供保护。而垂直流通风橱则可同时为使用者和培养的细胞提供良好的保护。超净工作台水平层流或垂直横流“超净工作台”不