盐析沉淀蛋白质时.ppt

第三章第三章 蛋白质的通性、纯化与表征蛋白质的通性、纯化与表征 1、蛋白质的理化性质：、蛋白质的理化性质：酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应色反应 2、分离纯化的方法：、分离纯化的方法：盐析、电泳、等电聚焦、层析等盐析、电泳、等电聚焦、层析等 3 3、表征：、表征：活力、比活力活力、比活力 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。度最小，在电场中不移动。在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白这种现象称为蛋白质电泳质电泳 1 1、酸碱性质、酸碱性质 阳离子 PHPI 兼性离子 PH=PI 可解离基团有末端和侧链可解离基团有末端和侧链 故故p pI I与酸性、碱性氨基酸的数目有关与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定 没有盐类没有盐类干扰时的干扰时的等电点叫等电点叫等离子点等离子点 蛋白质分子的颗粒直径已达蛋白质分子的颗粒直径已达1 1-100100nmnm，处于胶体处于胶体颗粒的范围颗粒的范围。因此因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质蛋白质具有亲水溶胶的性质。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。2 2、蛋白质的胶体性质：、蛋白质的胶体性质：蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力透膜，具有吸附能力 蛋白质溶液稳定的原因：蛋白质溶液稳定的原因：1 1）表面形成水膜（水）表面形成水膜（水化层）；化层）；2 2）带相同电荷。）带相同电荷。3)3)大小为大小为1 1-100nm100nm的胶体颗粒的胶体颗粒 +蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。出来。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 1.1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH50%(NH4 4)2 2SOSO4 4饱和度），清蛋白（饱和饱和度），清蛋白（饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4)。2.2.加有机溶剂加有机溶剂 3.3.加重金属盐加重金属盐 4.4.加生物碱试剂加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。沉淀生物碱，称生物碱试剂。在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和等电点沉淀法、盐析法和条件条件有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等。等。可逆沉淀可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。逆沉淀。不可逆沉淀不可逆沉淀 一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。其生物活性，称为蛋白质的变性。二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。并不引起一级结构的改变。蛋白质的变性蛋白质的变性 三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。四四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝凝固固。因此因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性凡凝固的蛋白质一定发生变性。反应名称反应名称 试试 剂剂 颜色颜色 反应有关基团反应有关基团 有此反应的有此反应的蛋白质或氨蛋白质或氨基酸基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫 色 或 粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄 色、橘色 Tyr、Phe 乙醛酸反应(Hopking-Cole 反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 Trp 坂口反应(Sakaguchi反应)-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 -氨基酸 4 4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量 OH N 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色色 5 5、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收 分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）的天然结构都没有发生变化）蛋白质的分离与纯化方法蛋白质的分离与纯化方法（一一）盐析与有机溶剂沉淀：盐析与有机溶剂沉淀：盐溶盐溶 1.1.盐析：盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白使蛋白质从溶液中沉淀析出质从溶液中沉淀析出，称为称为盐析盐析。常用的中性盐有：常用的中性盐有：硫酸铵硫酸铵、氯化钠、硫、氯化钠、硫酸钠等。酸钠等。盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的等电点处在蛋白质的等电点处效果最好。效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。质的变性。分段盐析：分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。2 2.有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇如乙醇、甲醇甲醇、丙酮等丙酮等，均可用于沉淀均可用于沉淀蛋白质蛋白质。沉淀原理是：沉淀原理是：脱水作用；脱水作用；使水的使水的介电常数降低介电常数降低，蛋白质溶解度降低蛋白质溶解度降低。（二）电泳：（二）电泳：带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为电泳电泳（electrophoresis)electrophoresis)蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷的正电荷，故可在电场中发生移动故可在电场中发生移动。不同的不同的蛋白质分子所带电荷量不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也且分子大小也不同不同，故在电场中的移动速度也不同故在电场中的移动速度也不同，据此据此可互相分离可互相分离。电泳电泳 蛋白质在等蛋白质在等电点电点pHpH条件条件下，不发生下，不发生电泳现象。电泳现象。利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。1.1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。行电泳。2.2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。带状区域。（1 1）纸上电泳：用滤纸作支持物。）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。聚丙烯酰胺）作支持物。（3 3）双向电泳）双向电泳 4 4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+5 5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。进行的电泳。-+两种凝胶电泳两种凝胶电泳 等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶在电场中不再移动。分离同工酶+5.0 6.0 7.0 5.0 6.0 7.0 通电+SDSPAGESDSPAGE中中SDSSDS的作用：的作用：阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致使得蛋白质的形状趋于一致 所以在这种特殊的电泳中，迁移所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋白质的大的形状无关，处决于蛋白质的大小（分子量）小（分子量）（三）层析：（三）层析：层析层析（chromatography)chromatography)是一种利用混合物是一种利用混合物中各组分理化性质的差异中各组分理化性质的差异，在相互接触的在相互接触的两相两相（固定相与流动相固定相与流动相）之间的之间的分布不同分布不同而进行分离分析的技术方法而进行分离分析的技术方法。主要的层析技术有离子交换层析主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层凝胶层析析，吸附层析及吸附层析及亲和层析亲和层析、HPLCHPLC等等。凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质（四）超速离心：（四）超速离心：利用物质密度的不同利用物质密度的不同，经超速离心后经超速离心后，分布于不同的液层而分离分布于不同的液层而分