猪血清IgG的分离纯化与鉴定.ppt

组员：陈忠浩组员：陈忠浩、赵静杰、郭献贵、于芳萍、赵静杰、郭献贵、于芳萍 发言人：郭献贵发言人：郭献贵 血清血清球蛋白的分离纯化与鉴定球蛋白的分离纯化与鉴定 2 Contents 材料与方法 结果与讨论 总结与感想 3 一、材料与方法一、材料与方法（一）试验材料（一）试验材料 1 1、供试材料、供试材料 采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h，析出血清，于析出血清，于4、8000r/min离心离心10min，除去血球和，除去血球和纤维蛋白原后，取上层血清，纤维蛋白原后，取上层血清，-20冰箱内保存备用。冰箱内保存备用。4 2 2、主要试剂、主要试剂 试剂名称试剂名称 规格规格 出产厂家出产厂家 三氯醋酸三氯醋酸 正辛酸正辛酸 氯化钠氯化钠 氢氧化钠氢氧化钠 盐酸盐酸 TrisTris 无水乙醇无水乙醇 醋酸醋酸 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 上海光铧科技有限公司上海光铧科技有限公司 衢州巨化试剂有限公司衢州巨化试剂有限公司 天津市永大化学试剂开发中心天津市永大化学试剂开发中心 上海三鹰化学试剂有限公司上海三鹰化学试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 杭州瓶窑和顺化工试剂厂杭州瓶窑和顺化工试剂厂 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 5 试剂名称试剂名称 规格规格 出产厂家出产厂家 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 甘油甘油 巯基乙醇巯基乙醇 SDSSDS 甘氨酸甘氨酸 溴酚蓝溴酚蓝 DEAE52DEAE52 过硫酸铵过硫酸铵 乙酸钡 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 分析纯分析纯 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 无锡市龙吉化工试剂有限公司无锡市龙吉化工试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 上海源聚生物科技有限公司上海源聚生物科技有限公司 天津市永大化学试剂开发中心天津市永大化学试剂开发中心 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 安徽三星树脂科技有限公司安徽三星树脂科技有限公司 上海三鹰化学试剂有限公司上海三鹰化学试剂有限公司 浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司 6 3 3、仪器设备、仪器设备 仪器名称仪器名称 型号型号 生产厂家生产厂家 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 S52S52 恒达仪器厂恒达仪器厂 电泳仪电泳仪 CS101CS101 上海精密科学仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司 低速大容量离心机低速大容量离心机 TDLTDL-5 5 上海安亭科学仪器厂上海安亭科学仪器厂 高速万能粉碎机高速万能粉碎机 FW100FW100 天津市泰斯特仪器有限公司天津市泰斯特仪器有限公司 数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅 HHHH-2 2 常州国华电器有限公司常州国华电器有限公司 真空干燥箱真空干燥箱 DZFDZF-60506050 上海一恒科技有限公司上海一恒科技有限公司 电子精密天平电子精密天平 ABAB-L L 梅特勒托利多仪器有限公司梅特勒托利多仪器有限公司 全温振荡（空气）培养箱全温振荡（空气）培养箱 QYCQYC-211211 上海福玛实验设备有限公司上海福玛实验设备有限公司 自动液相色谱分离层析仪自动液相色谱分离层析仪 MC99MC99-3 3 上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱电热恒温鼓风干燥箱 OHGOHG-907385907385-上海新苗医疗器械制造有限公司上海新苗医疗器械制造有限公司 酸度计酸度计 DELTADELTA-320320 梅特勒托利多仪器梅特勒托利多仪器(上海上海)有限公司有限公司 层析拄层析拄 1.01.03030 上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂 恒温磁力搅拌器恒温磁力搅拌器 9090-2 2 上海亚荣生化仪器厂上海亚荣生化仪器厂 7 A 猪血清IgG的提取 B 猪血清IgG的纯化 C 提取液蛋白含量测定 D 猪血清IgG分子量测定 8 1、猪血清IgG的提取正辛酸法 准确量取猪血清准确量取猪血清40mL40mL于于500mL500mL烧杯中，加入烧杯中，加入60mmol/L 60mmol/L pH4.0pH4.0醋酸缓冲液醋酸缓冲液160mL160mL，用氢氧化钠溶液调，用氢氧化钠溶液调pH4.5pH4.5。以每毫升稀释液加入以每毫升稀释液加入25L25L正辛酸的比例，在磁力搅拌正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min30min，44，50005000 r/minr/min离心离心30min30min，弃去沉淀。，弃去沉淀。上清液上清液44预冷，以预冷，以1mL1mL上清液加上清液加0.227g0.227g硫酸铵的比例，硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min30min，5000r/min5000r/min离心离心15min15min。将沉淀溶于将沉淀溶于20mL20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为上清液即为粗提粗提IgGIgG。9 2 2、猪血清、猪血清IgGIgG的纯化的纯化 将上述将上述IgGIgG粗品溶于少量生粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋，悬于装有理盐水后装入透析袋，悬于装有0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS的大烧的大烧杯中，于磁力搅拌器上杯中，于磁力搅拌器上44透析透析24h24h，每，每6h6h换一次液。换一次液。（1 1）透析脱盐）透析脱盐 10 取取2g2g预处理的预处理的DEAEDEAE-5252纤维素纤维素、装成、装成1.51.530cm30cm，柱床高，柱床高25cm25cm层析柱。层析柱。缓冲液缓冲液A(25mmol/L TrisA(25mmol/L Tris-HClHCl，pH8.8pH8.8，35mmol/L NaCl)35mmol/L NaCl)平衡。平衡。取取2mL2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A A平衡，至流出液在平衡，至流出液在280nm280nm波长洗脱曲线变得平直止。波长洗脱曲线变得平直止。以等量缓冲液以等量缓冲液A A和缓冲液和缓冲液C(25mmol/L TrisC(25mmol/L Tris-HClHCl，pH8.8pH8.8，500mmol/L NaCl)500mmol/L NaCl)连续连续梯度洗脱梯度洗脱；控制流速；控制流速1mL/min1mL/min。上样上样15min15min后分步收集并记录波峰，后分步收集并记录波峰，2mL/2mL/管，合并同一波管，合并同一波峰收集管。再用峰收集管。再用PBSPBS溶液透析，并进行分析鉴定。溶液透析，并进行分析鉴定。（2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化纤维素离子交换层析纯化IgG 11 3 3、提取液蛋白含量测定、提取液蛋白含量测定FolinFolin-酚法酚法 配制标准牛血清白蛋白进行配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验，用分酚法实验，用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。以蛋白质的浓度为横坐标，以蛋白质的浓度为横坐标，OD280OD280值为纵坐标，绘值为纵坐标，绘制标准曲线。制标准曲线。各粗各粗IgGIgG样品液定容至样品液定容至100mL100mL，按，按Folin-酚法酚法操作，操作，通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。12 4 4、猪血清、猪血清IgGIgG分子量测定分子量测定SDSSDS-PAGEPAGE 配制配制SDSSDS-PAGEPAGE凝胶。凝胶。将透析过的将透析过的IgGIgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热合后在沸水浴中加热5min5min，各取，各取20L20L加入凝胶板的加入凝胶板的样品槽中，进行电泳。样品槽中，进行电泳。取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，20min20min后用后用脱色液脱色。脱色液脱色。脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标样做出标准曲线计算样品样做出标准曲线计算样品IgGIgG分子量。分子量。13 电泳设备电泳设备 14 二、结果与讨论二、结果与讨论（一）正辛酸提取猪血清（一）正辛酸提取猪血清IgGIgG试验结果试验结果 血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。（二）猪血清（二）猪血清IgGIgG纯化结果纯化结果 透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。1、IgG的透析结果的透析结果 15 保留时间保留时间0 0-1.6h1.6h为缓冲液为缓冲液A A洗脱第一峰；洗脱第一峰；1.6h1.6h开启缓冲液开启缓冲液A A-C C线性梯线性梯度洗脱，获得第二峰；度洗脱，获得第二峰；图示两色谱峰分离效果较好，图示两色谱峰分离效果较好，分辨率高，无重叠。分辨率高，无重叠。2 2、DEAEDEAE-5252纤维素层析纯化纤维素层析纯化IgGIgG结果结果 用用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化，以纤维素离子交换柱进行纯化，以OD280nm为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：16 图图 福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线 （三）提取液蛋白含量测定结果（三）提取液蛋白含量测定结果 1 1、标准曲线、标准曲线 17 分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白质含量质含量1.45mg/mL1.45mg/mL，高盐峰样品蛋白质含量，高盐峰样品蛋白质含量为为.74mg/mLmg/mL。2 2、样品、样品IgGIgG含量测定含量测定 18（四）（四）SDSSDS-PAGEPAGE测测IgGIgG分子量结果分子量结果 猪血清、纯化的猪血清、纯化的IgGIgG样品经样品经SDSSDS-PAGEPAGE电泳结果如下：电泳结果如下：1标准蛋白标准蛋白 2 猪血清猪血清 3 纯化的纯化的IgG样品样品 19 IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键，还原成两条单链，再进一步与二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合结合成带大量负电荷的成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，蛋白复合物，SDS-PAGE电泳呈现两条较浓的条带。电泳呈现两条较浓的条带。猪血清球蛋白经正辛酸法提取，猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后，纯化后，所得所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。20 IgG相对分子质量标准曲线y=-4.3784x+2.1481R2=0.99830.000.501.001.502.002.500.000.100.200.300.400.50相对迁移率lgMW1 1、标准曲线制作、标准曲线制作 以标准蛋白质相对分子质量的对数（以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMwlgMw）为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下标准曲线。标准曲线。21 2 2、IgGIgG样品分子量测定结果样品分子量测定结果 根据样品根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查的迁移距离