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免疫胶乳浊度分析 在自动生化分析仪上的应用 免疫比浊回顾 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）在生化分析仪上进行测定的有关问题 2 免疫比浊 3 免疫检测的基础 抗原抗体间的特异性反应抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析 核心核心基础基础 免疫比浊技术是在免疫沉淀反应（Precipitation）检测法的基础上建立的。最早应用的免疫沉淀反应是Ouchterlony在1948年建立的琼脂双向扩散法。1965年Mancini等和Fahey等分别建立了可以定量的单向（辐射状）免疫扩散技术。Laurell等1966年建立了电免疫扩散法，使报告结果的时间由单向免疫扩散法的24h缩短到4-5h。4 免疫比浊 经典的免疫沉淀试验通常是在抗原与相应抗体反应的终点判定结果，存在费时、操作繁琐、敏感度低（10100mg/L）、不能自动化等缺陷。根据沉淀反应时，抗原抗体结合后可使反应系统透光度发生改变，建立了以测定透光度为特征的微量免疫沉淀测定法法，既免疫浊度测定技术。5 免疫比浊 1967年由Richie首次报告，20世纪70年代逐步完善，80年代初期初步应用临床常规检查。抗原抗体在液相（特殊的缓冲液）中快速结合，形成抗原抗体复合物，反应液出现浊度。6 免疫比浊 液相中抗原与抗体的反应结果与两者的浓度比例有关。抗原或抗体显著过量时，都只能生成少量的可溶性免疫复合物，分子极小，不适于免疫比浊法检测。免疫比浊技术要求溶液中抗体要保持中等过量，此时免疫复合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。在这种情况下，抗原与抗体的反应遵循质量作用定律（Ag+AbAg.Ab），形成IC的量是抗原或抗体的函数。当抗体固定时，IC的量与抗原的量成正比。7 免疫比浊 8 LIGHT SOURCE FILTER REACTION CUVETTE TURBIDIMETRIC DETECTOR NEPHELOMETRIC DETECTOR ICIC 散射比浊、透射比浊 光路图 透射光透射光+散射光散射光 散散 光光 射射 平光线平光线 目前，国内开展的各项免疫检验，均求使用国家食品药品监督管理局（SFDA）准入和批准的仪器和试剂。这样做不仅能使各项检查更加统一，规范，各实验室之间检查结果更具可比性，而且也可避免很多不必要的医疗纠纷。免疫比浊技术中散射比浊法目前均用获国家食品药品监督管理局（SFDA）批准进口的自动化分析仪器和配套的各种检测项目的专用试剂。透射比浊法（生化分析仪）可用国产试剂。9 全国临床检验操作规程 第3版 透射还是散射 散射比浊 专用仪器 专用配套试剂 原装进口试剂昂贵 透射比浊 生化分析仪 开放试剂 （可用国产试剂）10 a)速率法和终点法测定；b)速率法的灵敏度和特异性优于终点法；终点法的稳定性较好；透射还是散射 目前，由于技术的发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。生化分析仪通过免疫比浊法技术，架起了现代生化检验和现代免疫技术的桥梁。免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合。既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点。11 透射还是散射 透射免疫比浊 可溶性抗原与其特异性抗体，在一定缓冲液中形成的复合物，经一段时间聚合后出现浊度，人射光在渗过反应液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，可用吸光度A表示。用已知浓度的标准参考品建立标准曲线，测出待测抗原的含量。透射比浊法主要用于生化分析仪。12 透射免疫比浊 免疫复合物直径为35lOOnm，这一范围要求近紫外光处入射光发出最大的干扰(最大吸收峰)，选择290410nm波长测定最佳。由于抗原抗体结合后在短时间内(19s)形成可见的复合物，才能进行比浊。为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4聚乙二醇(MW：60008000)，可使复合物形成在310min完成。13 比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。为解决快速反应及微量化的要求，建立了免疫胶乳浊度法（immunolatex turbidimetry）。14 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）其基本原理是：a)将特异性抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。b)单个胶乳颗粒在入射光波之内，不阻碍光线透过；两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少。c)免疫微球凝聚的程度为被测物浓度的函数，由此可测出标本中待测物的含量。15 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）16(a)带抗体的胶乳在带抗体的胶乳在1个波长之内可透过光线个波长之内可透过光线 (b)结合后，则形成光线衰减结合后，则形成光线衰减 该技术的关键在于两个方面：首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。其次，胶乳与抗体结合时用化学交联虽好，但失活也较严重；一般用吸附法即可。17 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）18 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）胶乳颗粒多为惰性微球和羧基化微球 氨基化高分子纳米微球 氨基化纳米微球的颗粒大小较传统的微球更小（约0.1 m），它与抗体的结合是通过其表面的氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。与采用惰性纳米微球的传统技术相比，检测的灵敏度得到了极大的改善，最高可达到1.0ng/ml。19 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）（1）操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测血清蛋白含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义；（2）不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性都很好；（3）能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。20 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）胶乳比浊分析 颗粒增强透射免疫比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA）胶乳增强免疫浊度测定（Latex enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA）粒子强化免疫浊度测定 21 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry）22 生化仪上开展的免疫项目 serum proteins 血清蛋白类 IgA（免疫球蛋白A）IgG（免疫球蛋白G）IgM（免疫球蛋白M）IgE（免疫球蛋白E）C3（补体C3）C4（补体C4）Microalbumin （微量白蛋白）2-microglobulin （2球蛋白）-1-acid glycoprotein （-1酸性糖蛋白）Ferritin（铁蛋白）Transferrin（转铁蛋白）心血管疾病监测 Apo A-1（载脂蛋白A1）Apo B（载脂蛋白B）Lp(a)（脂蛋白a）h-CRP(超敏感C反应蛋白）Homocysteine （同型半胱氨酸）D-Dimer（D二聚体）Myoglobin（肌红蛋白）cTnI（肌钙蛋白I）23 生化仪上开展的免疫项目 Rheuma 风湿病 RF（类风湿因子）ASO（抗链O）CRP（C-反应蛋白）肾小球过滤率最敏感的 指标 cystatin C（胱抑素C）24 生化仪上开展的免疫项目 25 TDM治疗药物监测 Phenobarbital （苯巴比妥）Phenytoin（苯妥英纳）Valproic acid（丙戊酸）Carbamazepine （卡马西平）Theophylline（茶碱）Gentamicin（庆大霉素）Digoxin（地高辛）Digitoxin（洋地黄）Vitamins维生素 Vitamin B12 （维生素B12）Folate（叶酸）infectious Diseases 传染性疾病 TOXO（弓形体）RUBELLA（风疹病毒）生化仪上开展的免疫项目 26 免疫比浊法试剂的组成免疫比浊法试剂的组成 R1（试剂试剂 I）:缓冲液缓冲液 R2（试剂试剂 II）:启动试剂启动试剂 (带或不带乳胶颗粒带或不带乳胶颗粒)STANDARDS（标准液标准液）(一点或多点标准一点或多点标准)CONTROLS（质控液质控液）27 免疫比浊法试剂的组成免疫比浊法试剂的组成 R R1 1缓冲液缓冲液 R R2 2启动试剂启动试剂 校准血清校准血清 反应类型（不需要乳胶）Ag Ab(Reagent)28 反应类型（需要乳胶）LATEX PARTICLE Ag 29 30 试剂成份的功用试剂成份的功用 缓冲液:使反应有最大限度的敏感性使反应有最大限度的敏感性 避免非特异的结果避免非特异的结果 降低反应时间降低反应时间 启动试剂:产生抗原产生抗原-抗体反应抗体反应 标准液:建立浓度与信号（吸光度）之间的关系建立浓度与信号（吸光度）之间的关系 质控液:检查定标的情况检查定标的情况 CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准 31 32 CRM 欧共体参考局（BCR）的认可参考品。CRM470是14种（血清）蛋白分析物的参考制品。CRM470基于人血清（人血清蛋白参考制备物 lot 5，RPPHS lot 5）的Certified Reference Material 由以下组织共同发展：IFCC BCR Brussels CAP USA CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准 33 CRM 470在欧洲由BCR制备提供。在美国则由美国病理协会（CAP）提供材料。生产厂家用CRM470对自己的定标液和质控液进行标化。CRM和SRM（Standard Reference Material标准参考材料）可以认为是目前可以提供的最高质量的材料。SRM主要用于USA（国家标准和技术研究院NIST）。CRM470-全新的国际蛋白标准全新的国际蛋白标准 基于基于CRM470参考物的成人参考范围参考物的成人参考范围 CRM470参考物及其参考范围 血浆蛋白质 每个CRM470的参考范围（g/L）白蛋白 3552-1-抗胰蛋白酶 0.92.0（-1-抗胰蛋白酶抑制剂）C3C-补体 0.91.8 C4-补体 0.10.4 铜兰蛋白 0.20.6 C-反应蛋白（CRP）0.005-1-酸性糖蛋白（类粘蛋白）0.51.2 触珠蛋白 0.32.0 IgA 0.74.0 IgG 716 IgM 0.42.3-2-巨球蛋白 1.33.0 前白蛋白（transthyretin）0.20.4 转铁蛋白 2.03.6 注：C3C在新鲜样本中可期望较低的参考范围 34 35 a)a)对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理解。解。b)b)理解各个检测项目的方法学原理。理解各个检测项目的方法学原理。c)c)仔细认真阅读商品化试剂的说明书。仔细认真阅读商品化试剂的说明书。d)d)销售商或者厂家技术部门的支持。销售商或者厂家技术部门的支持。“所谓生化分析仪就是将实验参数输入仪器，由仪器按照试验指令来完成整个试验。参数设置，基本功在仪器之外，如果对分析化学、对酶动力学、仪器性能没有一定的掌握，是很难设置好参数的。”在自动生化分析仪上的应用在自动生化分析仪上的应用 36 免疫浊度法在生化分析仪上常见的测定（分析）方式 FINAL POINT D FINAL-SAMPLE BLANK D-A FINAL-INITIAL D-B KINETIC