淋巴细胞标志检测.ppt

细胞免疫学检测细胞免疫学检测（cellular immunoassaycellular immunoassay）一、淋巴细胞表面标志物检测一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for(Assay of membran molecules for lymphocyteslymphocytes）一、免疫细胞分离技术一、免疫细胞分离技术 (Technic of separation for immunocyte)(Technic of separation for immunocyte)二、免疫细胞表面标志检测技术二、免疫细胞表面标志检测技术 （Assay of membran molecules for Assay of membran molecules for ）三、免疫细胞功能检测技术三、免疫细胞功能检测技术 （Assay for Immunocyte Tuntion Assay for Immunocyte Tuntion）四、细胞因子与黏附分子检测技术四、细胞因子与黏附分子检测技术 （Assay for Cytokine and Adhesion Assay for Cytokine and Adhesion moleculemolecule）免疫系统免疫系统(Immune system)(Immune system)免疫器官免疫器官(Immune Organs)(Immune Organs)免疫细胞免疫细胞(Immunocyte)(Immunocyte)免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin)(Immunoglobulin)主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体 (Major Histocompatibility Complex;MHC)(Major Histocompatibility Complex;MHC)细胞因子细胞因子(Cytekine)(Cytekine)白细胞分化抗原和粘附分子白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte(Leukocyte Differentiation Antigen and Adhesion Differentiation Antigen and Adhesion molecule)molecule)免疫细胞免疫细胞(immune cells)(immune cells)指指:所有参与免疫应答或与免疫应答有所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞关的细胞 包括包括T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、单核吞噬细胞、单核吞噬细胞、树突状细胞及其他细胞细胞、树突状细胞及其他细胞 免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术(Separation of immunocytes)(Separation of immunocytes)人外周血人外周血(peripheral blood)(peripheral blood)白细胞分离白细胞分离 一、一、原理原理(principle)(principle)：红细胞红细胞/白细胞比例不同（白细胞比例不同（60060010001000）：）：1 1，密度不同，沉降速度不同。密度不同，沉降速度不同。二、方法二、方法(method)(method)：1 1、自然沉降法、自然沉降法 （直立静置（直立静置RT30RT3060min60min，紧贴红细胞层上的白，紧贴红细胞层上的白膜层）膜层）2 2、聚合物加速沉降法、聚合物加速沉降法 （加某些高分子物使（加某些高分子物使RBCRBC凝集成串加速沉降，凝集成串加速沉降，如如明胶）明胶）人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞（peripheral blood peripheral blood mononuclear cellsmononuclear cells，PBMCPBMC）的分离的分离 加入对倍稀释的血液样本加入对倍稀释的血液样本 水平式离心水平式离心20min时结果时结果 聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺(ficoll(ficoll-hypaque)hypaque)(1.0770.001g/L)分离人外周血淋巴细胞以密度为分离人外周血淋巴细胞以密度为1.0770.001/g/L PercollPercoll混悬液混悬液(处理过的硅胶处理过的硅胶颗粒颗粒)原液密度原液密度(density)(density)为为1.135g/L+1.135g/L+等量等量PBS,PBS,高速离心高速离心 (centrifugation)(centrifugation)由下而上的逐减的连续密度梯由下而上的逐减的连续密度梯度度(density gradient)(density gradient)淋巴细胞纯度淋巴细胞纯度98%,98%,单核细胞单核细胞纯度纯度78%78%流程长流程长,步骤繁步骤繁,成本高成本高 人外周血淋巴细胞人外周血淋巴细胞(亚群亚群)的分纯的分纯(purificcation)(purificcation)人外周血单个核细胞（人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞）主含淋巴细胞,但混有但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：（一）红细胞的去除（一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水）氯化铵、蒸馏水）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬）（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬）（四）淋巴细胞亚群的分离（四）淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离 分离依据：分离依据：1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（specific specific membrane molecule/surface markermembrane molecule/surface marker）2 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of antigen of cluster differentiation cluster differentiation；CDCD）分离方法：分离方法：1、Precipitation of E rosettePrecipitation of E rosette Erythrocyte Rosette forming cell;ERFCErythrocyte Rosette forming cell;ERFC The sueface of T lymphocyte contains the The sueface of T lymphocyte contains the receptor(CDreceptor(CD2 2)of sheep erythrocyte,which)of sheep erythrocyte,which is called E receptor for short.T lymphois called E receptor for short.T lympho-cytes can form E rosette with sheep cytes can form E rosette with sheep erythroerythro-cytes by its E receptor.cytes by its E receptor.Lymphocytes+sLymphocytes+sRBCRBC ,centrifugation,centrifugation-T lymphoT lympho-cytes(cytes(底底)/B lympho)/B lympho-cytescytes（界面界面）2、黏着性（理化）：、黏着性（理化）：B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附着淋巴细胞则不易附着（例）尼龙棉柱分离（例）尼龙棉柱分离 直接流出的是直接流出的是T淋巴细胞。淋巴细胞。3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞膜抗原的细胞（例）（例）1、亲和板结合分离、亲和板结合分离 (affinity(affinity)2 2、免疫磁珠分离、免疫磁珠分离 （immunomagnetic beadsimmunomagnetic beads）3 3、流式细胞术分离、流式细胞术分离 (FCM)(FCM)磁性微珠磁性微珠(magnetic beads):(magnetic beads):磁性微珠是以金属离子为核心，磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直胞表面抗原的特异性抗体（直接法）接法）;也可标记羊抗鼠也可标记羊抗鼠IgG抗抗体体(间接法），使分离细胞的范间接法），使分离细胞的范围大大扩大围大大扩大 正选正选（positive selectionpositive selection）法：法：磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 负选（负选（negtive selectionnegtive selection）法：）法：磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞细胞为所需细胞 一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大 评价评价(evalution)(evalution)：免疫磁珠分离法具有高纯度（免疫磁珠分离法具有高纯度（8080 9999），高得率），高得率（9090 9595）、高细胞活性（）、高细胞活性（99100%99100%）的特点，仅次）的特点，仅次或相当于流式细胞仪（或相当于流式细胞仪（FACSFACS）的分选效率。）的分选效率。与与FACS FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用相比，本方法操作简单、省时、经济；可用做做FACSFACS分选前的预分离，以减少分选前的预分离，以减少FACSFACS所用时间。所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达通常可达95959999。注意事项（注意事项（AttentionsAttentions）如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。打散细胞团块。用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞分离柱不被气泡阻滞 荧光激活细胞分离仪原理荧光激活细胞分离仪原理(principle)(principle)（fluorescence activated cell sorterfluorescence activated cell sorter，FACSFACS）细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处理，分辨细胞的类型。如识别的是所需的细胞时（