细菌内毒素验证.ppt

1 细菌内毒素方法验证 2 细菌内毒素验证基本程序 试验准备 确定样品内毒素限值 选择试剂 计算MVD 鲎试剂灵敏度复核试验 供试品干扰 初筛试验 干扰试验 结果判断 计算公式：MVD=cL/MVD为供试品的最大有效稀释倍数，c为供试品溶液的浓度，L供试品的细菌内毒素限值。如果计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式MVc=/L.3 鲎试剂灵敏度复核试验 根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后按所用的鲎试剂灵敏度2、0.5、0.25进行稀释。0.1ml鲎试剂+0.1ml标准品，平行4管；NC：0.1ml鲎试剂+0.1mlBET用水，平行2管371孵育60min2min。结果判断：反应管缓缓倒转180，阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落；阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。实验有效：NC管全部阴性（-），2.0 管全部阳性（+），0.25管全部阴性（-）。数据处理：灵敏度测定值c=antilg(X/n)。X：为反映终点浓度的对数值（lg),反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。4 干扰试验预试验 先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。例：某样品C：100单位/ml L：0.8 EU/单位 ：0.25 EU/ml MVD0.25=320倍 MVC0.25=/L=0.3125 单位/ml MVC0.125=/L=0.156单位/ml MVC0.06=/L=0.078单位/ml MVC0.03=/L=0.039 单位/ml 100单位/ml20单位/ml10 单位/ml5 单位/ml2.5 单位/ml1.25 单位/ml0.625 单位/ml0.3125 单位/ml0.156ml/ml0.078 单位/ml0.039 单位/ml 分别用4的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试品阳性对照。5 干扰试验预试验 结果一 供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验 结果二 供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验 供试品浓度供试品浓度 MVC0.25 MVC0.125 MVC0.06 MVC0.03 BET水水 供试品溶液-供试品阳性对照+MVC0.25 MVC0.125 MVC0.06 MVC0.03 BET水水 供试品溶液-供试品阳性对照-+6 干扰试验预试验 结果三 假阳性，更换另一批供试品进行测试 结果四 假阴性，消除干扰后再测试 供试品浓度供试品浓度 MVC0.25 MVC0.125 MVC0.06 MVC0.03 BET水水 供试品溶液+-供试品阳性对照+供试品浓度供试品浓度 MVC0.25 MVC0.125 MVC0.06 MVC0.03 BET水水 供试品溶液-供试品阳性对照-+7 正式干扰试验 根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。编号编号 内毒素浓内毒素浓度度/被加入被加入内毒素的内毒素的溶液溶液 稀释用稀释用液液 稀释稀释倍数倍数 所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度 平行管平行管 A 无/供试品溶液 2 B 2/供试品溶液 供试品溶液 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 4 4 4 4 C 2/检查用水 检查用水 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 2 2 2 2 D 无/检查用水 2 8 正式干扰试验 上张表中，A为供试品溶液，B为干扰试验系列；C为鲎试剂表示灵敏度的对照系列；D为阴性对照 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验 9 干扰试验结果举例 2（2）1（1）0.5（0.5）0.25（0.25）阴性对照 +-+-+-+-例1、批号1厂家1鲎试剂试验结果 2、批号1厂家2鲎试剂试验结果 3、重复做3批，计算结果 2（2）1（1）0.5（0.5）0.25（0.25）阴性对照 +-+-+-+-10 正式干扰试验接受标准 当阴性对照4管为阴性，两组最大浓度2均为阳性，最低浓度0.25均为阴性时，试验结果有效。Et/Es值在0.52（包括0.5、2）之间为无干扰，反之为有干扰 正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（Et）。Es=antilg(Xs/4)Et=antilg(Xt/4)Xs，Xt分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg）。11