细胞生死状态的鉴定——台盼蓝法.pptx

细胞生死状态的鉴定台盼蓝法 掌握血球计数板细胞计数法血球计数板细胞计数法以及死活细胞鉴定死活细胞鉴定的原理和常用方法。的原理和常用方法。一、实验目的：一、实验目的：细胞死活鉴定的方法有很多种，常用的有染色法染色法和仪仪器分析法器分析法。染色法简便，易于操作。但是通过直接的形态来鉴定细胞死活，实验结果很容易受主观因素的影响，存在一定的误差，因此，在实际操作中也常用一些仪器来进行精确的批量检测。不同的鉴定方法有不同具体的反应机理，但都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法化学染色法和荧光染色法荧光染色法。根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死细胞着色法（台盼蓝、氨基黑、赤藓红死细胞着色法（台盼蓝、氨基黑、赤藓红B）、活细胞着色法（结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝）。荧光、活细胞着色法（结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝）。荧光染色（吖啶橙染色（吖啶橙-活细胞细胞核呈黄绿色或亮绿色荧光死细活细胞细胞核呈黄绿色或亮绿色荧光死细胞细胞核呈红色荧光胞细胞核呈红色荧光).二、实验原理：二、实验原理：仪器分析法可采用微电极技术微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪流式细胞仪等，可对细胞的死活进行精确的批量检测。活细胞的细胞膜是一种选择性膜，而细胞死亡之后，细细胞死亡之后，细胞膜通透性增加胞膜通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝是一种阴离子型染料，不能透过完整的台盼蓝是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜细胞膜，所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色，甲基蓝有类似的染色机理。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。1、材料 贴壁细胞 2、试剂 0.4%的台盼蓝染液、0.25%的胰酶、含10%血清的1640培养液、PBS(磷酸缓冲盐溶液,一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用,保护生物蛋白的结构及生物特性，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释)3、器材 载玻片、盖玻片、倒置相差显微镜、试管、培养瓶（皿）、滴管、血球计数板 三、实验用品三、实验用品 1、试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4即可。2、细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，PBS清洗两遍，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液（消化细胞、收集细胞）12ml，静置35min,待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞。制成细胞悬液。四、实验方法：四、实验方法：3、染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中。加1-2滴（约0.1ml）染液，混合25分钟，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加，在普通光镜10物镜下计数计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。细胞密度的计算：细胞数/ml 原液=（四大方格细胞数之和/4）10000 4、根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：活细胞率（活细胞率（%)=%)=（细胞总数（细胞总数-死细胞数）死细胞数）/细胞总数细胞总数100%100%1、用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。2、务必使细胞分散成单个细胞，趋于计数前，应充分混匀细胞悬液。显微镜下计数时，遇到两个以上细胞组成的细胞团。应按单个细胞计算。如果细胞团10%。说明细胞分散不充分。3、台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，会干扰计数。最好在三分钟以内计数。五、注意事项 1.1.染色法是一种便捷的鉴定死活细胞的常用方法，染色法是一种便捷的鉴定死活细胞的常用方法，它通常利用了死活细胞哪两个性质上的差异？它通常利用了死活细胞哪两个性质上的差异？六.思考题答:细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。2.2.假如染色时间延长，对实验结果的判断会有影响吗？为什假如染色时间延长，对实验结果的判断会有影响吗？为什么？么？答：会有影响。因为细胞离开恒温环境太长会导致活细胞死亡，慢慢被染成蓝色，使得原本可以观察到的活细胞数目大大减少，即实验所得的活细胞率偏小。参考：百度图片；百度百科 细胞生物学实验指导.谨此感谢！