细胞工程7胚胎干细胞培养.ppt

C ELL ENGINEERING 细胞工程细胞工程 第一章第一章 绪论绪论 4 4个学时个学时 第二章第二章 实验室配置及基本技术实验室配置及基本技术 2 2个学时个学时 第三章第三章 植物细胞工程的理论基础植物细胞工程的理论基础 4 4个学时个学时 第四章第四章 植物组织器官培养技术植物组织器官培养技术 6 6个学时个学时 第五章第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产植物细胞培养及次生代谢产物生产 3 3个学时个学时 第六章第六章 原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3个学时个学时 第七章第七章 人工种子及植物种质资源保存人工种子及植物种质资源保存 2 2个学时个学时 第八章第八章 胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 2 2个学时个学时 第九章第九章 动物细胞培养动物细胞培养 4 4个学时个学时 第十章第十章 动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体 4 4个学时个学时 第十一章第十一章 动物组织与胚胎工程动物组织与胚胎工程 1 1个学时个学时 第十二章第十二章 试管动物与克隆动物试管动物与克隆动物 1 1个学时个学时 课程初步安排：课程初步安排：3636学时学时 第七章第七章 胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 干细胞是什么干细胞是什么 ES/EGES/EG细胞的培养及建系技术细胞的培养及建系技术 ES/EGES/EG细胞的体外诱导分化细胞的体外诱导分化 诱导分化细胞的永生化诱导分化细胞的永生化 ES/EGES/EG细胞技术学在医学中的应用细胞技术学在医学中的应用 ES/EGES/EG细胞技术学面临的问题和研究趋势细胞技术学面临的问题和研究趋势 一、干细胞（一、干细胞（stem cellsstem cells）是什么）是什么 具有无限的或延长的自我更新能力的细胞具有无限的或延长的自我更新能力的细胞 能产生至少一种类型的高度分化的细胞能产生至少一种类型的高度分化的细胞 从具有的分化潜能上讲：从具有的分化潜能上讲：-专能干细胞专能干细胞 -多能干细胞多能干细胞 -全能干细胞全能干细胞 从组织发生即来源上讲：从组织发生即来源上讲：-胚胎性干细胞胚胎性干细胞 -成体干细胞成体干细胞/组织干细胞组织干细胞 胚胎性干细胞胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。-来自早期胚胎：胚胎干细胞（来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES）-来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EGembryonic germ cells,EG）-来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonal carcinoma embryonal carcinoma cells,ECcells,EC）19811981年，年，EvensEvens和和MartinMartin分别成功的分离和体外培养了小鼠分别成功的分离和体外培养了小鼠 的胚胎干细胞；的胚胎干细胞；19951995年，年，ThomsonThomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎 干细胞；干细胞；19981998年，年，ThomsonThomson等建立了第一株人类胚胎干细胞；等建立了第一株人类胚胎干细胞；19981998年，年，ShamblottShamblott等建立了第一株人类生殖干细胞；等建立了第一株人类生殖干细胞；20022002年年3 3月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用 人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在 治疗心血管疾病等领域的应用潜力；治疗心血管疾病等领域的应用潜力；目前已有报导，目前已有报导，ESES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。成体干细胞（成体干细胞（adult stem cells,ASadult stem cells,AS），也叫作组织干细胞，也叫作组织干细胞（tissue stem cellstissue stem cells）是指一群分布在成体组织中处于尚是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。-造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。-骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。等不同分化细胞。二、二、ES/EGES/EG细胞的培养建系技术细胞的培养建系技术 分离囊胚的内细胞群分离囊胚的内细胞群 与成纤维细胞共培养，与成纤维细胞共培养，ESES细胞非分化增殖细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺细胞分离胚胎生殖腺细胞 胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定 定向诱导分化定向诱导分化 功能细胞功能细胞 1 1、ES/EGES/EG细胞的来源细胞的来源 (1)(1)发育良好的囊胚，从中分离发育良好的囊胚，从中分离ICMICM，进一步分离培养进一步分离培养ESES细胞细胞 (2)(2)从胚胎生殖腺中分离出从胚胎生殖腺中分离出EGEG细胞细胞 (3)(3)从畸胎瘤中分离出从畸胎瘤中分离出ECEC细胞细胞 (4)(4)治疗性克隆即体细胞核转移（治疗性克隆即体细胞核转移（SCNTSCNT）途径分离培养）途径分离培养ESES细胞细胞 2 2、ES/EGES/EG细胞的分化抑制培养细胞的分化抑制培养 目前常用的细胞分化抑制物主要有三种目前常用的细胞分化抑制物主要有三种:-饲养层细胞饲养层细胞(feeder layer)(feeder layer)-特殊细胞的条件培养液特殊细胞的条件培养液(conditioned medium),(conditioned medium),如如BRL(Buffalo rat liver)BRL(Buffalo rat liver)细胞条件培养液细胞条件培养液 -分化抑制因子分化抑制因子(differentiation inhibitory factor,(differentiation inhibitory factor,DIF),DIF),如白血病抑制因子如白血病抑制因子(leukemia inhitory factor,LIF)(leukemia inhitory factor,LIF)饲养层细胞培养法：饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：常用的饲养层细胞有下列两种：（1 1）MEFMEF细胞细胞(mouse embryonic fibroblast)(mouse embryonic fibroblast)，取自各种，取自各种品系小鼠的品系小鼠的12dpc12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。细胞培养为单层散布的成纤维细胞。（2 2）STOSTO细胞细胞，来自，来自SIMSIM小鼠小鼠(S)(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)(T)和和乌本苷乌本苷(O)(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)(stem cell factor,SCF)以及白血病抑制因子以及白血病抑制因子(leukemia(leukemia inhibitory factor,LIF)inhibitory factor,LIF)。无饲养层培养法：无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EGES/EG细胞培养显得较繁杂。细胞培养显得较繁杂。近来以近来以添加添加LIFLIF生长因子生长因子或或某些特定细胞的条件培养液某些特定细胞的条件培养液至含至含FCSFCS的正常培养液，借此替代饲养层细胞：的正常培养液，借此替代饲养层细胞：（1 1）直接在）直接在ESES细胞基础培养液中加入重组细胞基础培养液中加入重组LIFLIF （2 2）BuffaloBuffalo大鼠肝细胞条件培养液大鼠肝细胞条件培养液(BRL(BRL-CM)CM)（3 3）2 23 3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH(RH-CM)CM)3 3、ES/EGES/EG细胞系的特性和鉴定细胞系的特性和鉴定 （1 1）形态学特征）形态学特征 （2 2）发育全能性和分化潜能鉴定）发育全能性和分化潜能鉴定 （3 3）嵌合体动物）嵌合体动物 （1 1）形态学特征）形态学特征 体外培养小鼠体外培养小鼠ES/EGES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强。此界限不清楚，粘连性强。人人ESES与与EGEG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EGES/EG也有所也有所不同。单层培养时，人体不同。单层培养时，人体ESES细胞呈扁平状群落，且细胞界限细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。清楚。（2 2）发育全能性和分化潜能鉴定）发育全能性和分化潜能鉴定 小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外的分化特点。的分化特点。干细胞标记干细胞标记 鼠类鼠类EC 鼠类鼠类ES 鼠类鼠类EG 人类人类EC 人类人类ES 人类人类EG SSEA-1 +-+SSEA-3 -+SSEA-4 -+TRA-1-60 -+TRA-1-80 -+AKP +OctOct-4 4 +？+小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱 SSEAs(stageSSEAs(stage-specific embryonic antigen):specific embryonic antigen):时期专一性胚胎时期专一性胚胎抗原抗原 TRATRA-1 1-6060、TRATRA-1 1-81:81:肿瘤排斥抗原肿瘤排斥抗原 AKPAKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ESES细胞中活性较高，在已分化细胞中活性较高，在已分化细胞中活性明显降低；细胞中活性明显降低；OctOct-4 4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性多能性相关的转录因子，相关的转录因子，OctOct-4 4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转录，在细胞的全能的转